Метод камерного стекла для in vitro формирования бактериальной биопленки

Аннотация

Источник: Beaudoin, T. и др. Визуализация влияния мокроты на развитие биопленки с помощью модели с камерным стеклом. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео демонстрируется использование камерного крышного стекла для изучения влияния факторов мокроты, полученных пациентами при муковисцидозе, на развитие бактериальной биоплёнки.

Протокол

Все процедуры, связанные с сбором образцов, были выполнены в соответствии с руководящими принципами института IRB.

1. Метод формирования биопленки с камерным стеклом
   1. Выращивать интересный бактериальный изолят за ночь в нужной среде при 37 °C с встряхиванием (200 об/мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использовались различные бактерии, включая клинические изоляты Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, комплекс Burkholderia cepacia и Achromobacter xylosoxidans. Выбор среды зависит от интересующих штаммов и условий, однако для начальных экспериментов можно использовать (бульон Luria) LB-среду.
   2. Из ночной культуры поместите 40 мкл культуры в 4 мл свежей среды и выращивайте в течение 3-4 часов при 37 °C с встряхиванием (200 об/мин), чтобы получить культуру с оптической плотностью при 600 нм (OD600) примерно 0,5-0,6.
   3. Разведите культуру с шага 1,2 до 1/5 в желаемой среде фильтратом мокроты 10% или без фильтрата мокроты (в качестве контроля). Можно проверить и другие концентрации фильтрата мокроты (например, 50% или 100%).
   4. Используйте 200 мкл разбавления для засея в камерах затвора.
   5. Дайте бактериям прикрепиться в течение 4 часов при 37 °C без встряхивания.
   6. Через 4 часа снимите материал и аккуратно промыйте биопленку 1x свежим материалом. Замените на свежую массу 200 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения влияния мокроты на биопленку свежая среда должна содержать мокроту супернатант.
   7. Позволяйте биопленкам расти в течение нужного времени при 37 °C без встряхивания, заменяя медиа каждые 12 часов, без промывания до микроскопии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения влияния супернатантов мокроты на восприимчивость к биопленке антибиотики в среду добавляют антибиотики после 24 часов роста биопленки, которые сохраняются в среде до окрашивания и визуализации биопленок.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Lab-Tek II Chambered Coverglass, боросиликат #1.5, 8-колодец	Thermo Sicher Scientific	155409
Миллерс ЛБ Брот	Термо Фишер Сайентифик	12780-052	Стандартные среды для ночного роста/биопленки