Моделирование кишечной инфекции у личинок данио-рерио, используя пищевые бактерии

Аннотация

Источник: Флорес, Э. и др. Использование простейшего Paramecium caudatum как средство для заражения, передающихся пищей, у личинок данио-рерио. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео демонстрируется метод установления пищевой модели бактериальной кишечной инфекции у личинок данио-рерио, кормя их парамециями, инфицированными флуоресцентной кишечной палочкой.

Протокол

1. Пищевая инфекция данио-рерио
   1. Инкубировать бактерии с Paramecia.
      1. Подготовьте совместную культуру Paramecium caudatum и Escherichia coli MG1655 накануне инфекции. Объедините 8 мл среды E3, 1 мл продолжающейся парамеционной культуры и 1 мл культуры E. coli MG1655 (_{OD 600} = 1.0), ревзвешенных в 1x E3 в колбах для тканевой культуры T25. Инкубировать колбы при комнатной температуре (RT) на ночь. Для каждого лечебного заболевания подготовьте две фляжки парамеций.
      2. Инокулировать бактериальную среду роста (LB (лизогенный бульон): 1 г/л триптона, 0,5 г/л экстракта дрожжей, 1 г/л NaCl) инфекционным штамом бактерий, отбирая отдельную бактериальную колонию из пластины с помощью стерильной инокуляционной петли. Инкубировать жидкую культуру при 37 °C и оставить встряхивание при 110 оборотах в минуту (об/мин) на ночь.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо носить средства индивидуальной защиты (лабораторный халат и перчатки), а при работе с инфекционными агентами — использовать средства биобезопасности уровня 2.
      3. На следующий день измерьте_{OD 600} ночной культуры. Рассчитайте объём культуры, необходимый для достижения OD600 равного 1 при повторном взвешенном в 11 мл среды.
      4. Собирайте объём бактерий с помощью центрифугации в 6000 х г в течение 5 минут, по одному объёму на каждую колбу парамеций. Отбросьте супернатант и суспензуйте бактериальную гранулу в 1 мл среды E3.
      5. По желанию, предварительно окрашивайте бактерии флуоресцентным красителем.
         1. Добавьте 1 мкл бактериального окраления FM 4-64FX (5 мг/мл стандартного раствора). Накройте трубку фольгой для защиты от фотоотбеливания и инкубируйте вращающийся круг в сторону при RT (комнатной температуре) в течение 15 минут.
         2. Удалите лишний краситель, промывая 1x E3: Пеллетные бактерии центрифугированием при 6 000 x g в течение 1,5 минуты, затем снова суспензируйте гранулу в 1 мл среды E3. Повторите этап стирки два раза.
         3. Собирайте окрашенные бактерии с помощью cntrifugation в концентрации 6 000 г в течение 5 минут. Отбросьте супернатант и суспензуйте бактериальную гранулу в 1 мл среды E3.
      6. Добавьте по 1 мл бактериальной суспензии в каждую из двух колб свежих парамеций. Инкубировать на RT 2 часа.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если работаете с окрашенными бактериями, инкубируйте в темноте при RT 2 часа
2. Совместная культура бактерий и парамеций
   1. Содержимое обоих колб парамеций/бактерий объединяют в коническую трубку объёмом 50 мл. Центрифуга берёт образцы при 300 x g при 15 °C в течение 10 минут. Убедитесь, что центрифуга предварительно охлаждена перед этим этапом.
   2. Удалите примерно 10 мл супернатанта E3 с помощью серологической пипетки и добавьте примерно 10 мл свежего 1x E3 в коническую трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время всех этапов промывки крайне важно быстро снимать супернатант, так как парамеции начнут выплывать из гранулы. Вращайте и удаляйте супернатант из одной трубки за раз, чтобы обеспечить достаточно быструю обработку на этом этапе и избежать потери парамеции в супернатанте.
   3. Спин-образцы проводят с центрифугой при 300 x g при 15 °C в течение 5 минут. Удалите примерно 10 мл супернатанта E3 с помощью серологической пипетки и добавьте примерно 10 мл свежего 1x E3 в коническую трубку. Повторите этот шаг дважды.
   4. Центрифуга берет образцы при 300 г при 15 °C в течение 5 минут. Удалите примерно 10 мл супернатанта E3, стараясь не повредить гранулу.
   5. Суспензировать гранулы в оставшиеся 10 мл среды E3 и перевести 500 мкл подвески в новую микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл. Гранулируйте 500 мкл парамеций, центрифугируя при 300 x g в течение 5 минут, чтобы подсчитать количество парамеций.
   6. Удалите 400 мкл супернатанта E3 из образца объемом 500 мкл. Добавьте 20 мкл раствора формальдегидов 36,5% к оставшимся 100 мкл парамеций, аккуратно ресуспендуйте и инкубируем в течение 5 минут при 22 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап убивает парамецию, чтобы можно было считать.
   7. Измеряйте фактический общий объём с помощью пипетки и записи. Разведите суспензию парамеции в соотношении 1:1 В/В раствором 0,4% трипан-синего.
   8. Используйте счётчик клеток или гемоцитометр, чтобы подсчитать количество погибших парамеций/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за предыдущего этапа фиксации большинство парамеций уже мертвы на этом этапе, но это число отражает количество живых парамеций для эксперимента с ко-инкубацией. Авторы не обнаружили значимой смерти парамеций из-за бактериальной коинкубации, поэтому это можно не учитывать как фактор.
3. Совместная инкубация личинок парамеции и данио-рериба
   1. Рассчитайте концентрацию парамеций в конической трубке объёмом 50 мл
   2. Рассчитайте объём промытой парамеции, необходимый для концентрации 2 x 10⁵ парамеций/мл в итоговом объёме 3 мл E3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию парамеций можно регулировать в зависимости от желаемой дозировки бактерий, которая подлежит оптимизации.
   3. Анестезируйте данио-рерио, добавив трикаин в 100 мМ Tris pH 8.0 до конечной концентрации 100 мг/л. Переместите 10 данио-рериов в каждую яме шестиколочной пластины в общий объём 3 мл свежего E3 с соответствующей концентрацией парамеций. Убедитесь, что личинки перемещаются в минимальном объёме жидкости, чтобы обеспечить их восстановление после анестезии в отсеке получателя.
   4. Инкубировать при 30 °C в течение 2 часов в дневном инкубаторе при дневном освещении, чтобы обеспечить оптимальное освещение для охоты.
   5. Промывайте данио-рерио не менее 5 раз, перемещая рыбу в новый колодец с 3 мл свежего E3 с 100 мг/л трикаина каждый раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не пытайтесь исключить трикаин во время стирки. Перенос подвижных личинок без анестезии увеличивает риск повреждений и страданий животного.
   6. По желанию подготовьте данио-рерио для визуализации, вставив данио-рерио в 3 мл агарозы с низким содержанием 1% в пластине с чёрными стенками на 6 луночков: агароза с низким уровнем расплавления готовится в 1xE3 и нагревается в микроволновке. После расплавления добавьте трикаин до окончательной концентрации 160 мг/мл. Разместите рыбу под стереомикроскопом, используя защищённый гелевой наконечник, убедитесь, что голова слева, а хвост справа (рисунок 1). Подождите 5 минут, пока агароза застынет, затем наложите на вложённую рыбу 1x E3 с трикаином 160 мг/мл для визуализации.

Результаты

Рисунок 1: Колонизация данио-рерио бактериями. Данио-рерио при 5 dpf остались неинфицированными (A) или колонизированы mCherry, экспрессирующими (B), E. coli или (C) Salmonella e...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Paramecium caudatum, живой	Каролина	131554	Нет, не храните культуры ниже комнатной температуры
0,4% раствор Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	жидкий, стерильно фильтрованный, подходящий для культивирования клеток; Приготовлено в 0,81% хлорида натрия и 0,06% фосфата калия, дибазовый
Диметилсульфоксид (DMSO)	Sigma	276855-100МЛ	Храните в шкафу с растворителями
Escherichia coli, MG1655	ATCC	ATCC 700926	может быть заменён любым другим непатогенным штаммом E. coli
Окраска FM 4-64FX	Термо Фишер	F34653	Aliquot и Store Frozen
Формальдегид	Sigma	F8775-4X25ML
LB Broth	Sigma	L3397-1KG
Соляные таблетки с буфером фосфатов	Термо Фишер	18912014
Тетрациклин	Sigma	87128-25G	токсичный, раздражительный
Трикаин (этил3-аминобензоат метансульфонат)	Sigma	E10521-10G
Triton X-100	Sigma	X100-100ML
Раствор Trypan Blue, 0,4%	Sigma	93595-50МЛ
Агароза с низкой температурой плавления UltraPure	Термо Фишер	16520050
Гемоцитометр или счётчик клеток	любой
Стереомикроскоп	любой
Настольная центрифуга
Микроволновка
Вращательное колесо
Нагреваемый встряхивающий инкубатор
Водные сооружения
Резервуары для размножения