Разработка бактериальной монослойной биопленки с использованием электрохимического реактора

Аннотация

Источник: Tokunou, Y. и др., Электрохимическое обнаружение эффекта кинетического изотопа дейтерия на внеклеточный транспорт электронов у Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp . (2018)

В этом видео демонстрируется сборка и работа модели электрохимического реактора, предназначенной для имитации образования биопленки на поверхностях электродов. Контролируемая электрохимическая стимуляция способствует микробной адгезии, что приводит к постепенному образованию биопленки из бактериального монослоя.

Протокол

1. Строительство электрохимического реактора с тремя электродами (рисунок 1)
   1. В качестве рабочего электрода на дне реактора положите субстрат с оксидом индий-олова (ITO).
   2. Затем вставьте стеклянный цилиндр диаметром 2 см и крышку из политетрафторэтилена (PTFE). Затем вставьте в реактор хлорид серебра/серебра (Ag/AgCl) (хлорид калия, насыщенный KCl) и платиновый провод в качестве эталонного и контрэлектрода соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить утечку воздуха и раствора, между каждым компонентом вставьте лист из бутиловой резины.
   3. Добавьте в электрохимический реактор 4,0 мл определённой среды (ДМ), дополненную 10 мл лактата и 0,5 г/л дрожжей.
   4. После подтверждения отсутствия утечки из электрохимического реактора подают азотный газ в электрохимический реактор в течение 20 минут, чтобы поддерживать анаэробные условия внутри реактора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить загрязнение другими микробами, газ следует фильтровать до его попадания в электрохимический реактор.
   5. Подключите электрохимический реактор к потенциостату и подайте +0,4 В (против стандартного водородного электрода, SHE) к электроду ITO, поддерживая температуру электрохимического реактора на уровне 30 °C с помощью внешней системы циркуляции воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить воздействие внешнего электрического поля, электрохимический реактор следует помещать в клетку Фарадея.
2. Электрохимическое культивирование клеток S. oneidensis MR-1 (рисунок 1 и рисунок 2)
   1. Скорректируйте плотность ячеек суспензии, полученную на шаге 1.1, до оптической плотности 1,43 при 600 нм (_{OD 600}) с добавлением ДМ с добавлением 10 мМ лактата и 0,5 г/л экстракта дрожжей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить правильный_{OD 600}, примените суспензию ячейки_{OD 600} ≤ 0,8 к УФ-спектрометру перед регулировкой_{OD 600} на 1,43.
   2. Добавьте 0,3 мл суспензии ячейки в электрохимический реактор через порт впрыска с помощью шприца:_{OD 600} в реакторе превращается в 0,1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление суспензии ячеек объемом 0,3 мл с_{OD 600} = 1,43 в электрохимический реактор с средой 4,0 мл даёт 4,3 мл раствора с_{OD 600} = 0,1. При использовании других реакторов с разным объёмом требуется расчёт плотности ячеек.
   3. Продолжайте потенциальное применение при +0,4 В (против SHE) на электрод ITO в течение 25 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для образования монослойной биопленки на электроде ITO убедитесь, что полученный ток проявляет отклонение менее 50% от рисунка 2.

Результаты

Рисунок 1: Электрохимический реактор, использованный в этом исследовании. Фотография электрохимической ячейки до строительства (a) и после строительства (b). (c) Схематическая иллюстрация электрохимического реактора после 25 часов электрохимической инок...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Стеклянный цилиндр	Н/Д	Н/Д	Изготовлены на заказ, используемые в качестве электрохимического реактора
Укрытие и база PTFE	Н/Д	Н/Д	Изготовлен на заказ, использовался как крышка и основа электрохимического реактора
Бутиловая резина	Н/Д	Н/Д	Изготовление на заказ, вставляемое между каждым компонентом электрохимического реактора
Септа	GL Science	3007-16101	Используется как инжекторный порт электрохимического реактора
Электрод с оксидом индия (ITO)	GEOMATEC	No0001	Используется как рабочий электрод, 5 Ом/кв.
Насыщенный электродом Ag/AgCl KCl	ХОКУТО ДЕНКО	HX-R5	Используется как опорный электрод, Φ0,30 мм
Платиновая проволока	Кооператив Нилако	PT-351325	Используется в качестве противоответчика электрода
Лурия-Бертани (LB) Брот, Миллер	Бектон, Дичкинсон и компания	244620	Среда для предварительного выращивания S. oneidensis MR-1
Бакто агар	Бектон, Дичкинсон и компания	214010
NaHCO₃	Вако	191-01305	Используется для определённой среды (DM)
CaCl₂·2H₂O	Вако	031-00435	Используется для DM
NH₄Cl	Вако	011-03015	Используется для DM
MgCl₂·6H₂O	Вако	135-00165	Используется для DM
NaCl	Вако	191-01665	Используется для DM
2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил] этансульфоновая кислота (HEPES)	ДОДЖИНДО	346-08235	Используется для DM
Раствор натрия лактата	Вако	195-02305
Экстракт дрожжей Bacto	Бектон, Дичкинсон и компания	212750
оксид дейтерия (D, 99,9%)	Кембриджские изотопные лаборатории, Inc.	DLM-4-PK	Аддитив для экспериментов с эффектом кинетических изотопов
Инкубатор	ТОКИО РИКАКИКАЙ КО. ЛТД.	LTI-601SD	Используется для предкультивации
Шейкер	TAITEC	NR-3	Используется для предкультивации
Автоклавная машина	TOMY SEIKO CO. LTD.	LSX-500	Используется для стерилизации электрохимического реактора и среды
Чистая скамейка	SANYO	MCV-91BNF	Используется для предотвращения загрязнения электрохимического реактора и среды другими микробами
Центрифугный сепаратор	Эппендорф	5430R	Требуется скорость вращения до 6000×г
Генератор азотного газа	Puequ CO. LTD.	PNTN-2	Баллон с азотным газом также может использоваться вместо газогенератора
УФ-VIS спектрометр	СИМАДЗУ	UV-1800	Используется для оптимизации плотности ячеек
Potentiostat	BioLogic	VMP3	Используется для формирования биопленок и экспериментов с эффектом кинетических изотопов
Циркулятор термальной воды	КАК ОДНО	TR-1A	Используется для поддержания температуры электрохимического реактора
Клетка Фарадея	ХОКУТО ДЕНКО	HS-201S	Используется для электрохимических экспериментов