Визуализация окислительного стресса, вызванного патогенами, у C. elegans с использованием GFP-метированного SKN-1

Аннотация

Источник: Naji, A. и др. Изучение окислительного стресса, вызванного стрептококками группы Mitis у Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp . (2019)

В этом видео демонстрируется использование зелёного флуоресцентного белка SKN-1 у C. elegans для мониторинга окислительного стресса путем отслеживания зелёной флуоресценции. Черви, подвергшиеся воздействию S. gordonii , демонстрируют сильную ядерную флуоресценцию, что подтверждает стресс, вызванный патогеном, в то время как у тех, кто питается E. coli , демонстрируют диффузную зелёную флуоресценцию в цитоплазме, что указывает на минимальную активацию SKN-1.

Протокол

1. Наблюдение локализации SKN-1 в ответ на инфекцию Streptococcus gordonii

1. Добавьте ~100 личинок L4 к каждому экстракту дрожжей Тодда–Хьюитта (THY), засеянному стрептококком , и на каждую агаревую среду для роста нематод (NGM), засеянную Escherichia coli (E. coli). Используйте три пластины на каждый штамм бактерий. Инкубировать тарелки в течение 2–3 часов при 25 °C.
2. После этого вынимите пластины из инкубатора, промойте их модифицированным буфером M9 (M9W) и соберите червей в конические трубки по 15 мл.
3. Помой червей три раза.
4. Удалите большую часть M9W аспирацией и добавьте 500 мкл M9W, содержащего 2 мМ азида натрия или 2 мМ гидрохлорида тетрамизола в червячную гранулу. Это обезболивает червей, гарантируя, что при снимке под микроскопом не происходит никаких движений.
   ВНИМАНИЕ: Используйте средства индивидуальной защиты (СИЗ) при работе с азидом натрия. Подготовьте азидный раствор под химической вытяжкой.
5. Инкубировать червячные гранулы при комнатной температуре (RT) в течение 15 минут. Затем нанесите 15 мкл подвески червя на подготовленную агарозную подушечку. Аккуратно положите покров No1.5 на агарозную подушечку, содержащую анестезируемых червей.
6. С помощью флуоресцентного микроскопа визуализуйте локализацию транскрипционного фактора семейства скинхед 1 или SKN-1:GFP (Green Fluorescent Protein-tagged SKN-1) с использованием фильтров флуоресцеинового изотиоцианата (FITC) и 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). Изображения червячков с увеличением 10 и 20 раз.
7. Оценивайте червей по уровню локализации SKN-1. Отсутствие ядерной локализации, локализация SKN-1B/C::GFP (изоформа SKN-1 с меткой зелёного флуоресцентного белка B/C) в передней или задней части червя, а также локализация SKN-1B::GFP во всех клетках кишечника классифицируются соответственно как низкие, средние и высокие уровни локализации.
8. После оценки флуоресцентных микрофотографий определите статистические различия с помощью хи-квадрата и точных тестов Фишера с помощью статистического программного обеспечения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Среды и химические вещества
BD Bacto Тодд Хьюитт бульон	Fisher Scientific	DF0492-17-6
15 мл конических стерильных полипропиленовых центрифугных трубок	Fisher Scientific	12-565-269
Натрий-азид	Сигма Олдрич	S2002-25G
Гидрохлорид тетрамизола	Сигма Олдрич	L9756
Закрышки No1.5 размером 18 мм x 18 мм	Fisher Scientific	12-541A
Агарозе	Сигма Олдрич	A9539-50G
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + ROL-6(SU1006)	Кит Блэквелл