Подготовка мышиной модели аспирации ротоглотки для установления бактериальных инфекций лёгких

Аннотация

Источник: Nielsen, T. B. и др., Мышиная орофарингеальная аспирационная модель бактериальной пневмонии, связанной с вентилятором и приобретённой в больнице. J. Vis. Exp . (2018)

В этом видео демонстрируется процедура доставки бактерий через рохотку в лёгкие анестезированной мыши с целью индуцирования инфекции лёгких и запуска иммунного ответа.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Инокуляция/заражение мышей

1. Подвесить анестезиированную мышь, подвесив её за верхние резцы на прочной тонкой нитке (например, зубной нити), закреплённой на неподвижном объекте на высоте примерно вдвое длиннее тела мыши (например, 20 см) над рабочей поверхностью (например, лабораторный стол).
2. Аккуратно вытащите язык мыши изо рта, используя стерильные тупые щипцы. Перенесите язык на стерильный палец в перчатке, чтобы предотвратить случайное раздавливание языка мыши. Держите язык снаружи рта, обеспечивая доступ к рохотке и предотвращая глотание инокулума сбоку.
3. Держа язык мыши, помещайте 50-мкл инокулум (бактериальную суспензию) в ротоглотку с помощью микропипетки; Ротоглотка расположена на стыке ротовой полости и глотки ближе к задней части рта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно подавать жидкость только с помощью пипетки к первой точке микропипетки. Мышь перестаёт дышать на несколько секунд, когда инокулум помещается в ротоглотку; В конечном итоге рефлекторная аспирация заставляет мышь вдыхать бактериальную суспензию, о чём свидетельствует характерный потрескивающий звук жидкости, поступающей в лёгкие, что приводит к пневмонии.
4. Если инокулюм не расположен достаточно далеко назад, чтобы заблокировать нормальное дыхание, щипните нос щипцем, чтобы заставить рефлекторную аспирацию через рот и последующее вдыхание прививки.
5. После прививки отпустите язык, снимите мышь из подвесной верёвки, поместите её в клетку и следите за её пробуждением после анестезии.

2. Мониторинг прогрессирования заболевания

ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за страданий животных следует использовать различные индикаторы для обозначения моментов умирания мышей; эвтаназия должна проводиться после этого определения в соответствии с ранее утверждённым протоколом IACUC; Различные маркеры умирания включают температуру тела, потерю веса, внешний вид, походку и другие биомаркеры, которые можно получить из крови (например, через iSTAT).

1. Усыпить мышей согласно ранее утверждённому протоколу IACUC (например,_{CO 2} с вывихом шейки матки).
2. Удалять лёгкие у усыплённой мыши, перерезав трахею, легочную артерию и лёгочную вену рядом с лёгкими.
   1. Микроскопия
      1. Поместите лёгкие (или часть) в форму образца.
      2. Заполните форму образца оптимальной температурой резки (O.C.T.), полностью погружая ткань.
      3. Заморозьте образец при -80 °C.
      4. Отправьте образец в патологоанатомическую лабораторию для разреза и крепления на стекли для микроскопии.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Анестезиологическая палата	Kent Scientific Corporation	VetFlo-0720	Вмещает до 5 мышей
Криомолд, промежуточный размер	Sakura Tissue-Tek	4566	Одноразовые виниловые формы, 15×15×5 мм
Зубная нить	Орал-Б	37000469537	Привязывайте к стойке примерно на 6 дюймов выше уровня стола
Щипцы	VWR	82027-440	Использовался, чтобы аккуратно вытащить язык изо рта мыши
Изофлуран для анестезии	Эбботт	10015516	Можно использовать альтернативные препараты; Корректируйте процедуру соответственно
Картридж iSTAT	Эбботт	03P79-25	Доступны различные картриджи, которые соответствуют вашим потребностям
Кетамин, 100 мг/мл	Западное медицинское снабжение	4165	Разведите 1:10 в PBS до 1 мг/мл и смешайте с ксилазином при 1 мг/мл
Мазь для глаз	Акорн	Слёзы обновились	Избегайте касаться глаз кончиком дозатора
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)	Корнинг	21-031-CM	PBS Дульбекко без кальция и магния
Кончики пипет, 200 мкл	VWR	10017-044	Автоклав до использования
Пипеттер, 200 мкл	Гилсон	Pipetman P200	Автоклав и калибровка перед использованием
Распределитель, бактериальная клетка	Bel-Art	F377360006	Стерилизуйте с помощью выпечки или автоклава перед каждым использованием
Флакон, криоген, 2,0 мл	Корнинг	430659	Используется для криогенного хранения концентрированной бактериальной инокулы