Светоактивированная обработка бактериальных биопленок с использованием фотосенсибилизирующего прекурсора

Аннотация

Источник: Чжао, К. и др. Модель in vitro для изучения эффекта фотодинамической терапии, опосредованной 5-аминолевулиновой кислотой, на биопленку Staphylococcus aureus . J. Vis. Exp . (2018)

Видео демонстрирует фотодинамический протокол терапии для оценки антибактериального эффекта на грамположительные бактериальные биопленки. Биопленки делятся на четыре группы: две получают фотосенсибилизаторный прекурсор, две — буфер. Все они инкубируются в темноте, после чего следуют воздействие красного света на одну группу, обработанную прекурсорами, и одну группу только с буфером. Реактивные виды кислорода образуются только в группе, получающей и предшественник, и свет, что приводит к гибели бактериальных клеток. Жизнеспособность сравнивается между всеми группами для оценки эффективности лечения.

Протокол

1. Формирование биопленки

1. Образование биопленки в 96-ядровых микропластинах
   1. Получите штамм Staphylococcus aureus USA300 и 3 клинических штамма, образующих биопленку (C1-C3), хранящихся при -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Способность клинических штаммов образовывать биопленки была определена с помощью микротитрового теста.
   2. Инокуляция бактерии в среду соевого бульона с триптоном (TSB) объемом 5 мл и культивировать в инкубаторе с встряхиванием при 37 °C ночью до стационарной фазы.
   3. Центрифугуйте бактериальную культуру ночью при 4000 × г в течение 10 минут при 25 °C и выбросьте супернатант. Суспензировать гранулы в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) до конечной концентрации 2,0 × 10^единиц 9 колониообразующих (CFU)/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация бактерий оценивалась путём измерения оптической плотности и дополнительно определялась по подсчету пластин, что показало, что 1_{OD 600} суспензии содержит 1,5 × 10⁸ CFU/mL.
   4. Разведите бактериальную суспензию до 1:200 (1,0 × 10⁷ CFU/mL) в среде TSB, содержащей 0,5% глюкозы. Инокуляция 200 мкл бактериальной суспензии в каждую яме микропластины из полистирола, обработанной в клеточной культуре, на 96 луц.
   5. Инкубировать микропластину статически при 37 °C в течение 24 часов в хорошо насыщенной кислородом среде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации для формирования зрелой биопленки может варьироваться для разных бактериальных штаммов; это следует определить до эксперимента фотодинамической терапии (ФДТ).
   6. Сбросьте среду в колодцы, аккуратно промыйте микропластины PBS три раза, а затем выбросьте супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этап следует выполнять очень аккуратно, чтобы не нарушать образовавшуюся биопленку.

2. Световое облучение

1. Храните 5-аминолевулиновую кислоту (5-ALA) в холодильнике при температуре 4 °C. Перед экспериментом разведите 5-ALA PBS до 10 мМ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: раствор 5-ALA должен быть свежеприготовлен перед экспериментом.
2. В экспериментальной группе добавьте 200 мкл 10 мМ ALA в каждую лунку микропластины или 2 мл в культиваторную чашу. Накройте тарелку/миску алюминиевой фольгой и инкубуйте 1 час. Затем облучите пластину/тарелку светоизлучающим диодом (LED) с интенсивностью света 100 мВт/^см² в течение 1 часа, чтобы достичь дозы света 360 Дж/^см² при большой длине волны 633 ± 10 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы световая энергия эффективно и равномерно поступала в биопленку во всех колодцах/антеннах, зафиксируйте расстояние от пика источника света до колодца/антенны на уровне 6,0 см и ограничите экспериментальную область центральной областью облучения (10 см × 8 см). Чтобы результаты были воспроизводимы, эксперименты должны проводиться при той же комнатной температуре. На этапе светодиодного облучения, чтобы избежать прямого воздействия пластины на другие источники света, такие как солнечный свет, освещение в комнате или лампы, светодиод включался перед перемещением тарелки/тарелки в зону облучения, и свет был достаточно ярким для завершения работы.
3. Настройте контрольные группы (в нашем эксперименте было создано три контрольные группы).
   1. Для первой контрольной группы (ALA-LED-) добавьте 200 мкл PBS в каждую ячейку микропластины или 2 мл в посевную чашу. Накройте тарелку/миску алюминиевой фольгой и инкубуйте 2 часа.
   2. Для второй контрольной группы (ALA+LED-) добавьте 200 мкл 10 мМ ALA в каждую лунку микропластины или 2 мл в посевную чашу. Накройте тарелку/миску алюминиевой фольгой и инкубуйте 2 часа.
   3. Для третьей контрольной группы (ALA-LED+) добавьте 200 мкл PBS в каждую ямку микропластины или 2 мл в посевную чашу. Накройте тарелку/миску алюминиевой фольгой и инкубуйте её 1 час. Затем подвергите пластину светодиоду световым излучением 360 Дж/см^² при длине волны 633 ± 10 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этапе светодиодного облучения избегайте прямого воздействия пластины на другие источники света, такие как солнечный свет, освещение в комнате или свет лампы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Соевый бульон с триптоном (TSB)	OXOID	CM0129B
SYTO9	Термо Фишер Сайентифик	L7012	Наборы для бактериальной жизнеспособности BacLight LIVE/DEAD
Йодид провидия (PI)	Термо Фишер Сайентифик	L7012	Наборы для бактериальной жизнеспособности BacLight LIVE/DEAD
5-аминолевулиновая кислота (ALA)	Фудань Чжанцзян Био-Фарм	3.1
Штамм Staphylococcus aureus USA300			Ссылки на USA 300
Клинические штаммы Staphylococcus aureus (C1-C3)			Все клинические штаммы были выделены у пациентов с хроническим риносинуситом
96-ячественная микропластина	Корнинг Инк.	3599	Микропластины с плоским дном из полистирола, обработанные TC, индивидуально упакованные, с крышкой, стерильные.
Микроцентрифуга Эппендорфа 5417	Эппендорф	Z365998 | SIGMA
Инкубатор	Термо Фишер Сайентифик	SHKE4000	Настольные орбитальные шейкеры MaxQ 4000
Светодиодный светодиод	Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO	LED-IB