Подготовка образцов и визуализация флуоресцентно маркированных бактерий

Аннотация

Источник: Четрит, Д. и др. Применение живой клеточной визуализации и криоэлектронной томографии для выявления пространственно-временных особенностей системы секреции Legionella pneumophila dot/ICM. J. Vis. Exp. (2020).

В этом видео демонстрируется подготовка и визуализация флуоресцентно маркированных патогенных бактерий. Агазонные подушки сначала готовят и помещают в клеящуюся рамку. Суспензия генетически модифицированных бактерий, экспрессирующих флуоресцентный белок, наносится на прокладку для обездвиживания клеток. Затем рама запечатывается с помощью накладного скользя и наблюдается под микроскопом для запечатления флуоресцентных изображений бактерий.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, связанные с ростом, манипуляцией и визуализацией L. pneumophila , должны проводиться в лаборатории биологического уровня безопасности 2 в соответствии с местными рекомендациями.

1. Вставка sfGFP в хромосому легионеллы пневмофилы с использованием аллельного обмена и стратегии двойного отбора (Рисунок 1, Рисунок 2)

1. Клонируйте в генозаместительный вектор pSR47S11 следующую последовательность: 1000 п.п. вверх от интересующего участка, затем последовательность sfGFP, а затем 1000 bp ниже по течению от интересующего участка (рисунок 1). Последовательность sfGFP должна быть размещена в кадре к N-концу или C-концу с линкером, содержащим от четырёх до восьми аминокислот. Преобразовать полученный вектор в Escherichia coli DH5αλpir. Позже L . pneumophila (реципиент) выделяют отдельные колонии на агаре, содержащем 100 мкг/мл стрептомицина, и растёт в течение 5 дней при 37 °C (Рисунок 2).
2. Оставляйте полоски L. pneumophila на CYE-agar-стрептомицине и растите в течение 2 дней при 37 °C (густое пятно). Полоса E. coli DH5α трансформировалась с помощью плазмиды помощника pRK600 (хелпер) на LB-агаре, содержащем 25 мкг/мл хлорамфеникола. Разведите E. coli DH5αλpir (донор) на LB-агаре, содержащем 50 мкг/мл канамицин.
3. Проведите трипарентальное спаривование: инкубируют колонию помощника, колонию донора и реципиента, накладывая участки трёх штаммов на агарную пластину CYE без отбора и инкубируя в течение 4–8 часов при 37 °C. В качестве отрицательного контроля инкубировать смесь штаммов помощника+реципиента и смеси штаммов донор+реципиент на одинаковые периоды времени.
4. Суспензировать реакции спаривания в 500 мкл_{ddH 2}O. Пластинка 20 мкл и 50 мкл реакций на агаре CYE, содержащие 100 мкг/мл стрептомицина и 10 мкг/мл канамицина, и расти в течение 5 дней при 37 °C. Четыре из полученных клонов на агаре CYE, содержащие 100 мкг/мл стрептомицина, и расти в течение 5 дней при 37 °C.
5. Выделить 16 клонов на агаре CYE, содержащих 5% сахарозы и 100 мкг/мл стрептомицина, и расти в течение 5 дней при 37 °C. Затем 32 таких клона на CYE агар с 100 мкг/мл стрептомицина и на CYE агар с 100 мкг/мл стрептомицина и 10 мкг/мл канамицина и расти в течение 5 дней при 37 °C.

2. Изоляция клонов, интегрировавших sfGFP в хромосому L. pneumophila

1. Клоны Streak, чувствительные к канамицину на пластинках CYE-agar-стрептомицина, подтверждают внедрение sfGFP в хромосому с помощью цепной реакции колонии полимеразы (ПЦР). Используйте праймеры, комплементарные гену sfGFP и интересующей хромосомной области, чтобы усилить соединение инсерции.
   1. Смешайте по 0,5 мкл каждого раствора праймера с 10 мкм и одну колонию с итоговым объёмом 12,5 мкл и денатурируйте 10 минут при 95 °C. Охлаждайте на льду 10 минут, добавляйте 12,5 мкл 2x раствора ПЦР-мастер-смеси и проводите ПЦР-анализ.
2. Выращивать крупные участки изолированных колоний на пластинах CYE-agar-стрептомицина в течение 2 дней при 37 °C. Изучать уровни экспрессии и стабильность слияний SFGFP с помощью иммуноблотирования антителами к GFP.

3. Живоклеточная визуализация L. pneumophila с флуоресцентно маркированными точечными/ИКМ компонентами

1. Подготовка агрозных прокладок
   1. Сделайте около 30 мл 1% раствора агарозы с низким уровнем таяния в воде. Разогрейте в стеклянной термоволне около 90 секунд, время от времени покрушивая, пока агароза полностью не растворится.
   2. Поставьте две стеклянные слайды размером 22 x 22 x 0,15^{мм 3} на краю стеклянного стекла размером 25 x 75 x 1,1 мм^, одну поверх другой. Поставьте ещё два стеклянных стекла размером 22 x 22 x 0,15 мм³ стекла на другом краю.
   3. Пипеткой около 1 мл расплавленной агарозы вводят в центральное стекло между двумя верхними стеклянными стеклами, затем ставят ещё один слайд размером 25 x 75 x 1,1^{мм 3} поверх расплавленной агарозы. Старайтесь избегать образования пузырьков воздуха. Охлаждайте слайды при 4 °C в течение 15 минут.
   4. С помощью скальпеля или лезвия аккуратно нарежьте подушечку на маленькие квадраты, ~5 x 5^{мм 2}. Закрепите двухсторонний^{клей 17} x 28 x 0,25 мм 3^{на стеклянном} затворе 25 x 75 x 1,1 мм 3 и установите несколько подушек на затвор.
2. Получение изображений
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги описаны для микроскопа, находящегося под управлением SlideBook 6.0 и оснащённого твердотельными подсветителями, монохромной CCD камерой и объективом 100x (числовая диафрагма 1,4). При необходимости используйте альтернативные микроскопические устройства с соответствующими аппаратными и программными конфигурациями, которые можно настроить в соответствии с настройками протокола.
   1. Растворите плотный участок L. pneumophila в 1 мл_{ddH 2}O, вихрь и пипету 2–3 мкл разбавления на подушечки. Аккуратно положите накладку 50 x 24 x 0,15^{мм 3} на клейкую рамку.
   2. В окне захвата настройте ND на 180. Отрегулируйте биннинг на 2×2 и используйте канал 488 нм для экспонирования образца в диапазоне от 500 до 1 000 мс. Проверьте специфичность флуоресцентного сигнала, инициируя немаркированную L. pneumophila с теми же параметрами (рисунок 3).

Результаты

Рисунок 1: Схематический обзор гомологичной рекомбинации и аллельного обмена, используемых для вставки sfGFP в хромосому L. pneumophila.(A) Трипарентальное спаривание проводилось между хелпером E. coli

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100x План Апо (1.4 NA)	Nikon
ACES	Сигма-Олдрич	A9758
Активированный древесный уголь	Сигма-Олдрич	C5510
Agarose GPG/LMP, низкий плав	Американская биоаналитика	AB00981
Обезвоженный агар Bacto	BD	214010
Gene Frame, 1,7x2,8 см, 125 мкл	Fisher Scientific	AB-0578
L-Цистеин	Сигма-Олдрич	C7352
Стекла крышки микроскопа 22x22 мм	Fisher Scientific	12-542B
Стекла крышки микроскопа 24x50 мм	Fisher Scientific	12-545K
Микроскопические стекли 25x75x1 мм	Globe Scientific	1380
Слайдбук 6.0	Инновации в интеллектуальной визуализации
Световой двигатель Spectra X	Lumencor
Taq 2X мастер-микс	New England BioLabs	M0270
Титан Криос	Термо Фишер Сайентифик
Дрожжевый экстракт	BD	212750