Создание мышиной модели инфекции Clostridium difficile

Аннотация

Источник: Уинстон, Дж. А. и др. Модель клинически значимого штамма Clostridium difficile Clostridium difficile с помощью цефоперозона, обработанная с помощью цефоперазона, R20291. J. Vis. Exp . (2016)

В этом видео демонстрируется процедура инокуляции мышей, обработанных антибиотиками, спорами Clostridium difficile для создания мышиной модели инфекции для изучения патогенеза и реакций хозяина.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка инокулума спор Clostridium difficile и ротовая всадка мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей, испытывающих споры C. difficile , следует содержать в зооцентре уровня 2 уровня биобезопасности.

1. Получите запас спор C. difficile желаемого штамма (в данном случае R20291), который был подготовлен и хранён при 4 °C в стерильной воде. Определите перечисление этого запаса спор перед использованием.
2. Исходя из известной концентрации (спор/мл) спорного запаса, рассчитайте желаемое разбавление для получения 10⁵ спор на 25 мкл. Убедитесь, что объём инокуля достаточный для инокуляции всех мышей в эксперименте (25 мкл на мышь), для проведения перечисления инокуля (примерно 30 мкл) и учёта ошибки пипетирования.
3. Vortex — оригинальный запас спор C. difficile . Затем подвесьте рассчитанный объём (начиная с шага 1.2) исходного запаса споры C. difficile в стерильной воде внутри трубки микроцентрифуги с винтовой крышкой. Выполняйте это аэробно в ламинарном капюшоне. Определите эту разбавленную смесь как «споровый инокулум».
4. Поместите инокулум споры в водяную ванну при температуре 65 °C и нагрейте его 20 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап гарантирует, что после термической обработки останутся только активные споры C. difficile .
5. Внутри ламинарной вытяжки возьмите 50 мкл нагретого инокулума спор, поместите его в стерильную микроцентрифугную трубку и пропустите в анаэробную камеру. Используйте этот образец для перечисления спор.
6. Внутри ламинарного вытяжки загрузите оставшийся нагретый споровый инокулюм в шприц 1 мл, прикреплённый к стерильной игле желудка с лампочным наконечником. Используйте ручной шаговый шприц для обеспечения точного и быстрого повторного дозирования между мышами. Убедитесь, что игла гаваджа заполнена нагретым инокулюм спор перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Новая стерильная игла для каждой мыши не требуется. Однако при введении различных доз спор C. difficile рекомендуется использовать новую иглу для каждой дозы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: споры C. difficile очень устойчивы к традиционным дезинфицирующим средствам. Поэтому необходимо использовать спорицидный дезинфицирующий агент, например #62 Perisept Sporicidal Disinfectant. Производитель рекомендует использовать контакт 2 минуты для уничтожения спор C. difficile .
7. Дайте каждой мыши 25 мкл инокулума спор. Аккуратно удержуйте каждую мышь, схватив животное за обвисшую кожу шеи и спины, чтобы обездвижить голову. Использование указательного пальца дополнительно обездвиживает голову животного и удлиняет пищевод. Убедитесь, что животное не издаёт звуки и не проявляет других признаков беспокойства во время удержания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объём, получаемый мышам при гавери, не должен превышать 10 мл/кг массы тела (0,1 мл/10 г).
8. Держите мышь в вертикальном положении и аккуратно проведите иглу в бок рта. Направляйте иглу вдоль нёба рта и медленно продвигайте иглу в пищевод.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если возникает сопротивление, игла может проникать в трахею, поэтому её НЕ следует выдвигать вперёд, а немедленно удалять и перемещать.
9. После того как игла для гаваджа примерно наполовину погрузится в пищевод, введите 25 мкл нагретого инокуля споры и аккуратно уберите иглу из пищевода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Резкое движение иглы может привести к разрыву пищевода или желудка. Поэтому, если при продвижении иголки спуска возникает сопротивление, лучше немедленно удалить и переместить её.
10. Верните животное в клетку и наблюдайте за ним на наличие кашля или признаков дыхательной недостаточности, так как это может указывать на случайное введение трахеи или аспирацию нагретого инокуля спор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши крайне восприимчивы к C. difficile после обработки антибиотиками; Поэтому крайне важно принять меры предосторожности для предотвращения перекрёстного загрязнения между клетками. Это особенно важно при управлении мышами, обработанными антибиотиками, но без конкуренции в качестве контроля.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner	SSS Navigator	48027	Этот продукт требует разведения по рекомендации производителя
Мыши C57BL/6J	Лаборатория Джексона	664	Мыши должны быть в возрасте от 5 до 8 недель
2 мл винтовой крышки микроцентрифуги	Корнинг	430917