$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
- Получение образцов для перечисления Clostridium difficile (C. difficile)
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед получением содержания фекалий или цекалий взвесьте стерильные микроцентрифугальные трубки на аналитических шкалах. Запишите вес трубки на боковой стороне трубки, округляя до четырёх знаков после запятой (например, 0,9864 г). Обозначите этот вес как «груз трубки». Каждый взятый образец должен помещаться в стерильную взвешенную микроцентрифугную пробирку.
1. Стерильная коллекция мышиных фекалий- Аккуратно удерживайте каждую мышь, хватая животное за обвисшую кожу шеи и спины, чтобы обездвижить голову. Используйте мизинец, чтобы аккуратно удерживать хвост животного, обнажая анус. Убедитесь, что животное не издаёт звуки и не проявляет других признаков беспокойства во время удержания.
- Держите стерильную взвешенную микроцентрифугу прямо под анусом животного. Крайне важно, чтобы трубка не контактировала напрямую с мышью.
- Когда животное испражняется, собирайте фекальные гранулы в трубку. Держите пробирку при комнатной температуре, пока не будут собраны все образцы фекалий. Мыши может занять несколько минут, чтобы испражняться, поэтому приходится неоднократно пытаться собрать экскременты.
- Взвесьте трубки с фекалиями на аналитических весах. Запишите вес трубки, округляя до четырёх знаков после запятой (например, 1,0021 г). Обозначает полученный вес как «вес конечной трубы».
- После сбора кала пропустите образцы кала в анаэробную камеру для бактериального подсчёта.
- Бактериальное перечисление C. difficile
- Вычислите окончательный вес содержимого (фекалий), которые будут перечислены для C. difficile. Выполняли это, вычитая «окончательный вес трубки» из «веса трубки».
- Рассчитайте соотношение 1:10 разбавления содержимого до 1X фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и соответственно суспензируйте. Для фекальных гранул используйте кончик пипетки, чтобы аккуратно превратить гранулу в раствор.
- Анаэробно инкубировать эти вновь суспензированные образцы при комнатной температуре в течение 30 минут, давая содержимому осеть.
- Выполняйте последовательное разбавление для каждого образца в 1x PBS для перечисления единиц формирования колоний (CFU) на g содержания (фекалии). Выполняйте это анаэробно.
- Используя асептическую технику, перенесите по 100 мкл каждого последовательного разбавления на пластины таурохолата циклосерина цефокситин-фруктозного агар (TCCFA). Используя стерильный L-образный распределитель, распределите разбавление, приложенное на среду, чтобы равномерно распределить её по пластине. Равномерное распределение разбавления необходимо для точного перечисления колоний.
- Инкубировать пластины анаэробно в течение 24 часов при 37 °C. В этот момент перечислите колонии C. difficile , чтобы получить CFU на g содержания (фекалии). Колонии C. difficile плоские и бледно-жёлтые, имеют неправильные края и выглядеть как мелое стекло.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может использоваться для вычисления C. difficile из другого мышиного желудочно-кишечного (ГИ) содержания, включая подвздошное и толстичное содержание. Пластины полимеразной цепной реакции (ПЦР) могут использоваться для создания последовательных разбавлений.