Флуоресцентный анализ для изучения взаимодействия макрофаг-рецепторов с бактериальными антигенами

Аннотация

Источник: Барберо, А. М., et.al. Флуоресцентные анализы для изучения взаимодействия Mycobacterium tuberculosis с иммунным рецептором SLAMF1. J. Vis. Exp . ( (2025)

В этом видео демонстрируется флуоресцентный анализ для изучения взаимодействия макрофагового рецептора и антигенов Mycobacterium tuberculosis . Флуоресцентно меченые антигены на coverslip инкубируются экстрактами макрофагов, сшиваются, маркируются антителами и визуализируются с помощью перекрывающихся флуоресцентных сигналов.

Протокол

1. Взаимодействие Mycobacterium tuberculosis — SLAMF1 с помощью флуоресцентной микроскопии.

1. Перекрёстное связывание бактерий и белков
   1. Введите круглые 12-мм накладки в 24-колодцажевые культивные пластины (1 ковлсплей на каждую скважину) с помощью круглоносых хирургических пинцетов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно очистите покрытия этанолом 70%. При желании их можно автоклавировать или стерилизовать под ультрафиолетовым светом в течение 30 минут.
   2. Инкубировать накладку с 400 мкл поли-D-лизина 10 мкг/мл на ночь при 4 °C. Покрыть пластину алюминиевой фольгой для защиты от света.
   3. На следующий день достаньте тарелку из холодильника и дважды помойте накладку 1 мл воды.
   4. Дайте обложке высохнуть.
   5. Разбавить 20 мкл (2 x 10⁶) Mtb-R Ags в 180 мкл из 1x PBS. Последние 200 мкл достаточно, чтобы полностью покрыть прикрывающий ссыл.
   6. Инкубировать коверслип с Mtb-R Ags в течение 1 часа при 37 °C в клеточном инкубаторе.
   7. Сбросьте оставшуюся жидкость и дважды промой 1 мл 1x PBS (физиологический раствор с фосфатным буфером).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе правильное присоединение Mtb-R к накрытию можно проверить флуоресцентным микроскопом с помощью фильтров, соответствующих красному каналу.
   8. Добавьте 400 мкл блокирующего буфера (10% сыворотки плода бычьего скота (FBS) в 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) на 30 минут при RT в перемешивании (shaker).
   9. Промывайте дважды с помощью 400 мкл блокирующего буфера.
   10. Инкубировать с 100 мкл белкового экстракта, разбавленного в 300 мкл 1x PBS в течение 2 часов при RT в перемешивании (шейкер).
   11. Добавьте 400 мкл 1% формальдегида, разбавленных в 1x PBS. Инкубировать 15 минут под возбуждением (шейкером) в RT.
   12. Добавьте 500 мкл глицина 0,125 м, разбавленного водой. Инкубировать 5 минут под перемешиванием (shaker) на RT.
   13. Мойте дважды с 1 мл 1x PBS.
   14. Добавьте 400 мкл 2 мМ этиленгликоля биса (сукцинимидилсукцинат) (EGS на 1 час при RT в перемешивании (шейкер).
   15. Повторите шаг 1.1.13
       ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется подготовка реагентов в момент использования.
2. Окрашивание SLAMF1
   1. Обмотайте крышку тарелки с культурой в парафиновую плёнку.
   2. Добавьте каплю 60 мкл предварительно титрированного первичного антитела против SLAMF1 (разбавление 1:75) на крышку, покрытую парафиновой пленкой.
   3. Аккуратно снимите накладку с пластины с помощью изогнутых хирургических пинцетов и игл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения удаления скольжения иглы можно согнуть примерно под углом 45°.
   4. Переверните каплю поверх капли с антителом. Инкубировать 30 минут на RT в темноте.
   5. Поднимите защитный слой и дважды промой с помощью блокирующего буфера.
   6. Инвертируйте ковер поверх новой капли с вторичным антителом (разбавление 1:200). Инкубировать 30 минут на RT в темноте.
   7. Повторите шаг 1.2.5.
   8. Удалите лишнюю жидкость и закрепите накладку на каплю жидкости для монтажа, размещённую на стеклянном затворе.
   9. Наблюдайте под флуоресцентным микроскопом с помощью соответствующих фильтров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется работать в стерильных условиях. Разбавьте антитела в блокирующем буфере. Аккуратно обращайтесь с накладкой, чтобы избежать царапин, которые могут затруднить наблюдение под микроскопом. Настоятельно рекомендуется использовать монтажную жидкость, подходящую для флуоресценции.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Вторичное антитело Alexa Fluor 488	Инвитроген	A21121	Для флуоресцентной микроскопии
Первичное антитело против SLAMF1	BioLegend	306302	Для флуоресцентной микроскопии
Aqua-Poly/Mount	Полинауки	18606-20	Монтажные носители
Скользящие 12 мм	HDA	-	Для анализа взаимодействия с помощью микроскопии
EGS	ThermoFisher Scientific	21565	Для лечения сшивания
Формальдегид	Merck	K47740803613	Для лечения сшивания
Стеклянные слайды	Стеклянный класс	-	Для анализа взаимодействия с помощью микроскопии
Глицин	Sigma	G8898	Для лечения сшивания
Imager.A2	Карл Цейсс	430005-9901-000	Флуоресцентный микроскоп с модулем подсветки Colibri 7
Поли-D-лизин	Сигма Олдрич	А-003-М	Для лечения покрытий
Родамин B	Сигма Олдрич	21955	Для М. Окрашивание при туберкулезе