Разработка модели заражения личинками данио-рерио-рерио с использованием микрогаважа

Аннотация

Источник: Ли, Дж . и др. Разработка модели заражения личинками данио-рериба для Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).

В этом видео демонстрируется процедура микрогаважа, при которой анестезированная личинка данио-рерио обездвиживается агарозой и внутрь, вводя патогенную бактерию с помощью игли, управляемой трассером. Неинвазивная доставка имитирует естественную инфекцию, позволяя анализировать размножение бактерий, высвобождение токсинов и повреждение эпителия кишечника.

Протокол

1. Гаваж личинок данио-рерио

1. Откалибруйте иглу микрогаважа.
2. Измерьте диаметр кончика иглы, положив иглу на калибровочный затвор с помощью одной капли минерального масла. Убедитесь, что наконечник имеет диаметр 30–40 мкм, тупой и гладкий. Отбросьте острые или грубые иглы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Острые края игл можно притупить быстрым пламенем.
3. Приготовьте раствор для гаваджа.
4. Загрузите и закрепите иглу на микроманипуляторе.
5. Отрегулируйте микроманипулятор так, чтобы игла была под углом 45°.
6. Анестезия личинок данио. Когда личинки перестают двигаться, перенесите их в борозду микрогаважной формы с помощью пипетки Пастера.
7. Нанесите каплю агарозы с низким уровнем плавления 0,8% на личинки данио-рерио, чтобы прикрыть. Аккуратно отрегулируйте личинки так, чтобы головы стояли вертикально под углом 45° в канавке и хвосты прижались к стенке канавки. Убедитесь, что углы головок примерно одинаковы, чтобы они были совпадают с углом игл гаважа. Поместите форму микрогаважа на лёд на 30–60 секунд, чтобы агароза с низким таянием затвердела и стабилизировала положение личинок.
8. Регулируйте давление впрыска в диапазоне 200–300 гПа. Установите время инъекции на 0,1–0,3 с, чтобы получить объём инъекции 3–5 нл Clostridioides difficile.
9. Аккуратно проведите иглой через агарозу, затем в рот личинок данио-рерио, через пищевод. Когда кончик иглы окажется внутри передней кишечной луковицы, нажмите на педаль инъекции, чтобы выпустить бактерии. Заполните просвет кишечника доставленным объёмом. Не позволяйте ему переполняться из пищевода или клоаки. Аккуратно вынимите иглу изо рта данио-рерио.
10. После подачи спасите заражённые личинки данио-рерио, используя гибкий кончик микрозагрузчика, сначала отрезав агарозу, а затем подняв личинки. Перенесите эти личинки в стерильную среду Даньо с содержанием 30%. Промывайте личинки в стерильной среде дважды. Перенесите личинки в свежую чашку Петри диаметром 10 см. Личинки поддерживаются до 11 дней после оплодотворения (dpf).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Агарозе	Сигма-Олдрич	A2576	Агароза с ультранизким содержанием геля
Агароза с низким плавлением (LM)	Pronadisa	8050	Он используется в агарозных пластинах
Капиллярное стекло	Аппаратура Гарварда	30-0019	Инъекционные иглы
Clostridioides difficile			R20291, штамм риботипа 027, производство TcdA+/TcdB+/CDT+
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
ФИДЖИ	Платформа с открытым исходным кодом		Обработка изображений
HEPES	Carl Roth GmbH	6763
Горизонтальный игольчатый вытягиватель	Sutter instrument Inc	P-87
L-цистеин	Сигма-Олдрич	168149
Пакет приложений Leica X (LAS X)	Leica		Обработка изображений
Микроинжектор	Эппендорф	5253000017
Микроинжекционные формы	Инструменты адаптивной науки	TU1
Конфокальный микроскоп Leica SP8	Leica
Фенол Ред	Сигма-Олдрич	P0290
Хлорид калия (KCl)	Carl Roth GmbH	5346
Хлорид натрия (NaCl)	Carl Roth GmbH	9265
Таурохолат	Carl Roth GmbH	8149
Трикаин	Сигма-Олдрич	E10521
Экстракт дрожжей	BD Bacto	212750