Инокуляция бактериального патогена в листья арабидопсиса посредством вакуумной инфильтрации

Аннотация

Источник: Руфиан, Й. С., et.al. Одноклеточный анализ экспрессии генов Pseudomonas syringae в тканях растений. J. Vis. Exp . (2022)

В этом видео демонстрируется метод вакуумной инфильтрации для внесения бактериального патогена в листья растений Arabidopsis . Метод использует подготовленную бактериальную суспензию и вакуумные импульсы для равномерного проникновения через устьицы, что приводит к контролируемой инфекции листьев.

Протокол

1. Инокуляция растений Arabidopsis

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании штаммы Pseudomonas syringae pv. помидор DC3000 и P. syringae pv. использовались phaseolicola 1448A.

1. Приготовьте инокулюм P. syringae .
   1. Выведите интересующий штамм P. syringae из глицерила с температурой −80 °C на пластину LB (10 г/л триптона, 5 г/л NaCl, 5 г/л экстракта дрожжей и 16 г/л бактериологического агара), дополненную соответствующими антибиотиками. Инкубировать при 28 °C в течение 40-48 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать антибиотики, если интересующий штамм несёт плазмиду или ген геномной устойчивости. Рекомендуемые концентрации антибиотиков для P. syringae следующие: канамицин (15 мкг/мл), гентамицин (10 мкг/мл), ампициллин (300 мкг/мл).
   2. Соскребли бактериальную биомассу и повторно взвесьте в 5 мл 10 мМ_{MgCl 2}. Измерьте_{OD 600} и отрегулируйте до 0,1, добавив 10 мМ_{MgCl 2}.
      ПРИМЕЧАНИЕ: _{OD 600} при 0,1 культуры P. syringae соответствует 5 x 10⁷ CFU·^mL−1.
   3. Проведите последовательные разбавления до 10 мМ_MgCl2 для достижения конечной концентрации инокуля 5 x 10⁵ CFU·^mL−1. Подготовьте 200 мл инокулума для растений Arabidopsis .
   4. Непосредственно перед прививкой добавьте поверхностно-активное вещество Silwett L-77 к конечной концентрации 0,01% для Arabidopsis. Обратите внимание, что Силветт несколько вреден для ткани арабидопсиса .
2. Проведите вакуумную инфильтрацию.
   1. Для проникновения Arabidopsis положите две деревянные палочки, образующие букву X над горшком (рисунок 1E), и поставьте горшок лицом вниз на чашку Петри диаметром 14 см с инокулумом объёмом 200 мл (рисунок 1F).
   2. Вставьте растения, погруженные в раствор инокулюма, в вакуумную камеру (рисунок 1G) и подайте импульс 500 мбар в течение 30 секунд для проникновения в листья. Повторите вакуумный импульс 2-3 раза, пока лист полностью не будет инфильтрирован (рисунок 1H).
   3. Сливите лишний раствор инокуля с помощью бумаги и верните растения в соответствующую камеру роста.

Результаты

Рисунок 1: Бактериальная инокуляция и экстракция апопласта с использованием растений Arabidopsis . (A) Подготовка горшки с правильным прикреплением металлической сетки. (B) Сеять семена зубочисткой ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
140 мм тарелки Петри			Особых требований нет.
Бактериологический агар	Роко
Гентамициновый сульфат	Дюшефа	G-0124
Канамицин моносульфат	Фитотехнология	K378
MgCl₂	Мерк
NaCl	Мерк
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Триптон	Мерк
Вакуумная камера диаметром 25 см	Картелл	554
Вакуумный насос	ГАСТ	DOA-P504-BN
Дрожжевый экстракт	Мерк
Ампициллин натрий	GoldBio