Высокопроизводительная визуализация внутриклеточной инфекции Brucella abortus в эпителиальных клетках хозяина

Аннотация

Источник: Casanova, A. и др. Микроскопические анализы для высокопроизводительного скрининга факторов хозяина, участвующих в инфекции клеток гела бруцеллой . J. Vis. Exp . (2016)

Это видео демонстрирует высокопроизводительную визуализацию инфекции Brucella abortus в эпителиальных клетках с помощью сиРНК-опосредованного STING knockdown, чтобы изучить роль цитозольного сенсора ДНК в внутриклеточной бактериальной репликации и врожденном иммунном ответе хозяина.

Протокол

1. Инфекция и фиксация

1. За день до заражения инокулируйте определённое количество стартовой культуры B. abortus в среде 50 мл TSB/км (триптический соевый бульон с содержанием 50 мкг/мл канамицина) в бутылке с винтовой крышкой объемом 250 мл. Запечатайте бутылку парапленкой и выращите бактерии на ночь при 37 °C и 100 об/мин на орбитальном шейкере до_{OD 600} = 0,8-1,1.
2. Измерьте_{OD 600} бактериальной культуры и подготовьте инфекционную среду, разбавляя бактериальную культуру в DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) /10% FCS (сыворотка плода телята) для достижения желаемого множественности инфекции (MOI).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения уровня заражения 5-10% в клетках HeLa используется MOI 10 000. Для достижения оптимальных показателей инфекции необходимо провести кривую титрирования MOI для каждого типа клеток.
3. Замените трансфекционную среду пластины с 384 лунками на 50 мкл инфекционной среды с помощью автоматической мойки пластин.
4. Центрифугуйте пластину с 384 лунками при температуре 400 г и 4 °C в течение 20 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это помогает синхронизировать процесс заражения.
5. Запечатайте пластину парапленкой и инкубируете её на предварительно нагретой алюминиевой пластине в влажном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2 в течение 4 часов.
6. Промыйте клетки с помощью DMEM/10% FCS, содержащего 100 мкг/мл Гм (гентамицина), чтобы инактивировать внеклеточные бактерии с помощью автоматической мойки пластин (используйте промывку 200 мкл/переливание скважины).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время промывки с переливанием автоматическая мойка пластин одновременно отпускает и аспирирует среду.
7. Для входного анализа промывайте ячейки второй раз с DMEM/10% FCS с содержанием 100 мкг/мл Gm и 100 нг/мл aTc с использованием автоматической мойки пластин (используйте промывку 200 мкл/скважину).
8. Запечатайте пластину парапленкой и верните её в предварительно нагретую алюминиевую пластину в влажном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2 ещё на 40 или 4 часа соответственно для анализа конечной точки и входного анализа.
9. Для фиксации промывайте скважины PBS (физиологическим раствором с фосфатным буфером) с помощью автоматической мойки пластин (используйте промывку 200 мкл/переливающий скважину).
10. Заменить PBS на 50 мкл 3,7% параформальдегида (PFA) в 0,2 млн HEPES при pH 7,4 с помощью автоматической шайбы пластин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внимание: PFA токсичен при вдыхании, контакте с кожей и при проглатении.
11. Инкубировать 20 минут при комнатной температуре.
12. Замените фиксационную среду на 50 мкл PBS с помощью автоматической мойки пластин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы теперь готовы к извлечению из BSL3 при необходимости.
    ВНИМАНИЕ: Удаление любого образца с объекта BSL3 (уровень биобезопасности 3) подлежит оценке риска и валидации процедуры, а также применяется в соответствии с нормативами по биобезопасности.

2. Окрашивание пятен

1. Промывайте клетки дважды с 50 мкл PBS.
2. Пермеабилизировать клетки в 50 мкл 0,1% Triton-X-100 в PBS в течение 10 минут.
3. Промывайте клетки три раза с помощью PBS. Добавьте 20 мкл PBS, содержащего 1 мкг/мл DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол), и инкубировать 30 минут при комнатной температуре.
4. Промыйте клетки три раза в PBS и защитите пятна от света алюминиевой фольгой.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Триптический соевый бульон (TSB)	Fluka	22092
Канамицинсульфат	Сигма-Олдрич	60615
Бутылка с винтовой крышкой объёмом 250 мл	Корнинг	8396
DMEM	Сигма-Олдрич	D5796
Сыворотка для плода телята (FCS)	Gibco	10270	Инактивированный теплом
Пластина Greiner CELLSTAR с 384 лунками	Сигма-Олдрич	M2062
Отлупываемая алюминиевая фольга	Costar	6570
Диспенсер реактивов: «Диспенсер реагентов Multidrop 384»	Thermo Scientific	5840150	Можно использовать альтернативный диспенсер реагентов.
Реагент для трансфекции: «Липофектамин РНКиМАКС	Инвитроген	13778-150
Автоматическая мойка пластин: «Мойка пластин ELx50-16»	BioTek	ELX5016	Эта шайба пластин содержит 16-канальный коллектор, подходящий для пластин с 384 лунками. Он помещается в шкаф для биобезопасности и имеет крышку, закрывающую пластину во время мойки, что снижает риск образования аэрозолей. Можно использовать альтернативные шайбы с похожими характеристиками.
Гентамицин	Сигма-Олдрич	G1397
PBS	Gibco	20012
Параформальдегид	Сигма-Олдрич	P6148	Растворить в буфере HEPES 0,2 M, pH 7,4. Храните при -20 °C и разморозите свежим за день до использования. Осторожно: PFA токсичен при вдыхании, контакте с кожей и при проглатывании.
HEPES	Сигма-Олдрич	H3375
Triton X-100	Сигма-Олдрич	T9284
DAPI	Рош	10236276001
Kif11 siRNA	Дхармакон	L-003317-00
ARPC3 siRNA	Дхармакон	L-005284-00
Brucella abortus 2308
HeLa CCL-2	ATCC	CCL-2
ImageXpress Micro	Молекулярные устройства	IXM IMAGING MSCOPE	Автоматизированный клеточный микроскоп для визуализации, оснащённый прецизионизированной моторизованной Z-ступенью. Могут использоваться альтернативные системы для автоматизированной микроскопии и альтернативные компоненты для жёстких и программных компонентов, указанных ниже.