Фотоотбеливающие цианобактериальные пигменты для визуализации белков, регулирующих рост,

Аннотация

Источник: Zhan, Y. , и др. Фотоотбеливание позволяет проводить сверхразрешающую визуализацию кольца FtsZ у цианобактерии Prochlorococcus. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео демонстрируется процедура фотоотбеливания пигментов в цианобактериальных клетках с использованием ксенонового света в холодных условиях для улучшения флуоресцентной визуализации белков, регулирующих рост.

Протокол

1. Фотоотбеливание хлорофилловых пигментов на этапе блокировки

1. Перенесите накладку на маску с пятнами. Добавьте сверху 50 мкл блокирующего буфера, который содержит 0,2% (v/v) неионный детергент-100 и 3% (v/v) козьей сыворотки, сверху покрытия.
2. Поместите всю окрашивающую пластину на лёд и переместите её под источник ксенона для фотоотбеливания не менее 60 минут, при интенсивности света 1800 мкмоль/м²·с.
3. После фотоотбеливания и блокировки аккуратно удалите блокирующий буфер, впитывая его краем бумажного полотенца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность ксенонового света настолько высока, что для защиты глаз нужны подходящие солнцезащитные очки. Тем временем обмотайте источник света и пластину алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить утечку света, которая может привести к повреждению глаз. Проверяйте накладку каждые 15 минут, чтобы убедиться, что она остаётся влажной. Если он сухой, добавьте 50 мкл блокирующего буфера.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Полистиролные частицы	Сферотек	PP-20-10	2,0-2,4 мкм
Перекрытие	Мариенфельд	111580	18 мм ∅, толщина No 1
Этанол	Шарлау	ET00021000
Поли-L-лизин гидробромид	Сигма-Олдрич	P9155	MOL масса 70 000–150 000
Параформальдегид	Сигма-Олдрич	158127
Глутаральдегидный раствор, 50%	Сигма-Олдрич	340855
PBS	Sigma	P3813
Triton X-100	Sigma	T8787
ЭДТА — динатриевая соль, 2-гидрат	Биотехнология золота	E-210-500
База Тризмы	Sigma	T1503
Лизоцим	Sigma	L6876
Козья сыворотка	Sigma	G9023
Ксеноновый источник света XD-300			250 Вт