Обнаружение восприимчивости бактериальных антибиотиков с помощью стимулированного рамана-рассеяющего микроскопа

Аннотация

Источник: Zhang, M. и др., Быстрое тестирование на антимикробную восприимчивость с помощью стимулированной рамановской рассеяющей визуализации инкорпорирования дейтерия в одной бактерии. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео демонстрируется применение стимулированной рамановской рассеяющей микроскопии для оценки восприимчивости к антибиотикам путём отслеживания метаболической активности, маркированной дейтерием. Отслеживая сигналы углерод-дейтерий, метод позволяет быстро обнаруживать устойчивые и восприимчивые бактериальные популяции.

Протокол

1. D₂O Инкорпорирование лечения в присутствии антибиотиков (рисунок 1a)

1. Проверьте концентрацию бактерий, измеряя оптическую плотность (OD) с помощью фотометра на длине волны 600 нм.
2. Разведите бактериальный раствор с помощью обычной среды бульона Мюллера-Хинтона (MHB), не содержащей дейтерия, чтобы достичь конечной концентрации клетки 8 x 10⁵ CFU/mL. Аккуратно перемешайте бактериальные клетки.
3. Подготовьте 300 мкл аликвотов бактериального раствора в семи микропробирках по 1,5 мл и 600 мкл аликвотов бактериального раствора в одной микропробирке объёмом 1,5 мл.
4. Добавьте 4,8 мкл стандартного раствора антибиотика (гентамицин или амоксицилл) (1 мг/мл) в микропробирку с 600 мкл бактериального раствора, чтобы итоговая концентрация антибиотика достигла 8 мкг/мл.
5. Возьмите 300 мкл раствора из 8 мкг/мл бактериального раствора с антибиотиками и добавьте ещё 300 мкл бактериального раствора, чтобы получить двухкратно разбавленный раствор с антибиотиком (4 мкг/мл), содержащий бактерии.
6. Повторяйте двойное серийное разбавление тестовых антибиотиков — гентамицина или амоксицилина — до достижения микротрубки с минимальной концентрацией (0,25 мкг/мл), и сбрасывают 300 мкл из пробирки. Для гентамицина и амоксицилина последовательные концентрации варьируются от 0,25 мкг/мл до 8 мкг/мл.
   1. Оставьте одну трубку без антибиотиков для контроля пустостей. Это будет положительным контролем для проверки метаболической активности бактерий без антибиотиков, но с лечением_{D 2O}.
   2. Оставьте одну трубку без антибиотиков и без_D2Oдля отрицательного контроля.
7. Инкубировать бактериальный аликвот определённым антибиотиком (гентамицином или амоксицилином), содержащим среду MHB, в течение 1 часа.
8. Во время инкубации приготовьте серийное разбавление антибиотиков с 100% средой с_D2Oс тем же градиентом концентрации, что и антибиотики, приготовленные на этапе 1.6. Для гентамицина и амоксицилина последовательные концентрации варьируются от 0,25 мкг/мл до 8 мкг/мл.
9. После 1 часа обработки антибиотиками добавьте 700 мкл серийно разбавленного антибиотика и 100% Mhb среду с D₂O-содержащей MHB в 300 мкл предварительно обработанных бактерий в той же концентрации антибиотика (приготовленные на этапе 1.6) соответственно.
   1. Например, добавьте 700 мкл среды MHB с 100% D₂O-содержащей (содержащей 8 мкг/мл антибиотика) к 300 мкл бактерий, предварительно обработанных антибиотиками, 8 мкг/мл. Аналогичным образом перенесите в соответствующие трубки следующей концентрации и угомогенизуйте, несколько раз поднимая и опуская трубку.
   2. Добавьте 700 мкл MHB среды без антибиотиков 100%_D2O-содержащей MHB в 300 мкл бактерий без антибиотиков (подготовленных на шаге 1.6.1) в качестве контроля.
   3. Инкубировать при 37 °C в шейкере при 200 об/мин дополнительно 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе итоговая концентрация_{D 2O}в среде для теста составляет 70%.
10. Сначала центрифугуйте 1 мл антибиотика и обработанного D₂O-образца бактерий при 6200 x г в течение 5 минут при 4 °C, затем дважды промывайте очищенной водой. Наконец, зафиксируйте образцы в растворе формалина 10% и храните их при 4 °C.

2. Стимулированное рамановское рассеяние (SRS) визуализации метаболического включения_{D 2}O в одну бактерию

1. Промыйте 1 мл раствора фиксированных бактерий очищенной водой, затем центрифугуйте при 6200 x г в течение 5 минут при 4 °C. Удалите супернатант. Обогатить бактериальный раствор примерно до 20 мкл.
2. Нанесите бактериальный раствор на покрытое поли-L-лизином стекло. Сделайте сэндвич и запечатайте образец для SRS-визуализации.
3. Снимите бактерии на колебательной частоте C-D на 2168 см-1 с помощью SRS-микроскопа.
   1. Вводите и настройте длину волны насоса до 852 нм с помощью программного обеспечения управления на компьютере.
   2. Измеряйте мощность лазера с помощью измерителя мощности. Установите мощность насосного лазера на образце на ~8 мВт, а мощность лазера Стокса на образце на ~40 мВт, регулировав полуволновую пластину перед выходом лазера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В микроскопе SRS регулируемый фемтосекундный лазер с частотой повторения 80 МГц обеспечивает насос (680–1300 нм) и возбуждающие лазеры Стокса (1045 нм).
4. Регулировав винты зеркал отражения, пространственно выровняют пучки насоса и Стокса и направляют их в вертикальный микроскоп с системой 2D гальвозеркала для лазерного сканирования.
   1. Используйте объектив погружения в воду 60x, чтобы сфокусировать насос и лазеры Стокса на образце.
   2. Используйте масляный конденсатор, чтобы собрать сигналы от образца в прямом направлении.
   3. Используйте полосный фильтр, чтобы отфильтровать лазер Стокса перед тем, как направить его в фотодиод.
   4. Извлекать стимулированный рамановский сигнал с помощью усилителя фиксации и обнаруживать сигналы фотодиодом.
5. Установите каждое изображение SRS так, чтобы оно содержало 200 x 200 пикселей и время задержки пикселей на 30 мкс, в панели управления программы. Общее время получения одного изображения составляет ~1,2 с. Установите размер шага на 150 нм, чтобы размер изображения был примерно 30 x 30 мкм². Изображение как минимум трёх поля зрения для каждого образца.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Акусто-оптическая модуляция	Гуч и Хаусго	R15180-1.06-LTD	Модулирующий лазерный луч Стокса
Амоксициллин	Сигма Олдрич	A8523-5G
Полосный фильтр	Хрома	HQ825/150m	Блокируйте лазерный луч Стокса перед фотодиодом
Хлорид кальция	Сигма Олдрич	C1016-100G	Корректировка катионов
Катионно-адаптированный бульон Мюллера-Хинтона	Fisher Scientific	B12322	Тестирование антимикробной чувствительности микроорганизмов методами разбавления бульона
Центрифуга	Thermo Scientific	75002542
Обложные очки	VWR	16004-318
Культивная трубка с защищённой крышкой	Бренд Fisher	149569B
Оксид дейтерия		151882	Органический растворитель для растворения антибиотиков
Оксид дейтерия-d6	Сигма Олдрич	156914	Органический растворитель в качестве стандарта для калибровки системы визуализации SRS
Escherichia coli BW 25113	Центр генетических запасов Coli	7636
Полипропиленовые микроцентрифугные трубки Eppendorf объёмом 1,5 мл	Бренд Fisher	05-408-129
Гентамициновый сульфат	Сигма Олдрич	G4918
Гидрофильные фильтры с фторидом поливинилидена	Миллипор-Сигма	SLSV025NB	Размер поры 5 мкм
Фемтосекундный импульсный лазер InSight DeepSee	Спектра-физика	Модель: insight X3	Настраиваемый лазерный источник и фиксированный лазерный источник на 1045 нм для SRS-визуализации
Усилитель с блокировкой	Zurich Instrument	HF2LI	Демодуляция сигналов SRS
Масляный конденсатор	Олимп	U-AAC	NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)	Коллекция американской типографической культуры	ATCC 47085
Фотодиод	Хамамацу	S3994-01	Детектор
Полипропиленовая коническая трубка объёмом 15 мл	Falcon	14-959-53A
Полипропиленовые фильтры	Thermo Scientific	726-2520	Размер пор 0,2 мкм
Стерильные чашки Петри	Корнинг	07-202-031
Шприц 10 мл	Бренд Fisher	14955459
УФ/ВИС спектрофотометр	Бекман Коултер	Модель: DU 530	Измерение оптической плотности при длине волны 600 нм
Вихревой миксер	VWR	97043-562
Водная цель	Олимп	UPLANAPO/IR	60×, NA 1.2