Установление бактериальной инфекции у личинок дрозофилы

Аннотация

Источник: Hiroyasu, A., D и др., Извлечение гемоцитов из личинок Drosophila melanogaster для микробной инфекции и анализа. J. Vis. Exp .(2018)

В этом видео демонстрируется процедура установления бактериальной инфекции у личинок дрозофилы , помещая их в бактериальную каплю и прокалывая вольфрамовой иглой. Личинки затем инкубируются на борозенной, богатой питательными веществами агаровой пластине для изучения взаимодействий хозяина и патогена.

Протокол

1. Инфекция in vivo

1. Разогрейте тарелку с фруктовым соком Drosophila при комнатной температуре 15 минут.
   1. Добавьте 30 г агара в 700 мл воды и обложите автоклавом на 40 минут.
   2. Растворить 0,5 г метилпарабена в 10 мл абсолютного этанола.
   3. Добавьте раствор метилпарабена в концентрат фруктового сока объёмом 300 мл.
   4. Быстро смешайте концентрат сока в автоклавном растворе агара и налейте 5 мл в чашки Петри диаметром 10 × 35 мм.
   5. После того как тарелки остыют на 15 минут, храните их при 4 °C.
2. Подготовьте личинки третьего возраста.
3. Положите дрожжовую пасту на агаровую тарелку. Сделайте мелкий разрез на агарной пластине, где личинки могут мигрировать, чтобы избежать высыхания (рисунок 1A). Соберите стрелку из вольфрамового заострения толщиной 0,001 мм с фиксирующими щипцами с помощью парафиновой пленки (рисунок 1B, C).
4. Пипетка 50 мкл высокотитрного mCherry express-Coxiella burnetii (5,95×10⁹ ГЭ/мл) на парафиновую пленку под стереомикроскопом и поместить личинки в бассейн бактерий.
5. Поместите личинок в бассейн бактерий, проколите их вольфрамовой иглой (рисунок 3D) и перенесите на агарную пластину (рисунок 1E).
6. Перенесите оставшуюся патогенную среду на агарную пластину и запечатайте её парафиновой пленкой.
7. Держите личинок на тарелке во влажном воздухе до желаемого времени после заражения (рисунок 1F). В этом эксперименте личинки, инфицированные C. burnetii, находятся на пластине в течение 24 часов.

Результаты

Рисунок 1: Инфекция in vivo. А) Тарелки фруктового сока Drosophila и дрожжевая паста используются для инкубации инфицированных личинок in vivo . В агарной пластине делают разрезы для обеспечения долголетия личин...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Стереомикроскоп	Amscope	SM-1BSZ-L6W
Щипцы	VWR	82027-402
Coxiella burnetii - mCherry	Доктор Хайнцен, Р.
Тарелки с фруктовым соком Drosophila	Протоколы Холодной Спринг-Харбор		http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
Агар	Биореагенты Fisher	BP1423-500
Метилпарабен	Амреско	0572-500G
Абсолютный этанол	Биореагенты Fisher	BP2818-500
Замороженный концентрат Welch's 100% Grape juice, 340 мл	Amazon	B0025UJVGM
Чашки Петри, 10 x 35 мм	Fisher Scientific	08-757-100A
Дрожжи, Bakers Dried Active	MP Biomedicals	210140001	Добавьте 2 части воды к 1 части дрожжей (v/v)
Вольфрамовая игла	Тонкие научные инструменты	10130-20
Удержание щипцов	VWR	HS8313
Listeria monocytogenes	ATCC	Штамм: 10403S	Штамм Listeria monocytogenes 10403S (Bishop и Hinrichs, 1987) был выращиван в бульоне Difco Brain-heart infusion (BHI) (BD Biosciences), содержащем 50 мкг/мл стрептомицина при 30 °C.