Одноклеточный анализ экспрессии генов из растений экстракций

Аннотация

Источник: Руфиан, Х. С. и др. Одноклеточный анализ экспрессии генов Pseudomonas syringae в тканях растений. J. Vis. Exp . (2022).

В этом видео демонстрируется метод анализа экспрессии генов у патогенных бактерий, экстракцированных из растений, на уровне одной клетки с использованием флуоресцентно маркированного транскрипционного фактора. Конфокальная визуализация выявляет гетерогенность экспрессии генов вирулентности, подчёркивая функциональное разнообразие внутри клональной бактериальной популяции.

Протокол

1. Одноклеточный анализ бактерий, экстракцированных апопластом

1. Приготовьте раствор агарозы 1,5% в дистиллированной воде. После плавления добавьте достаточно объёма, чтобы заполнить пространство между двумя микроскопическими слайдами, расположенными рядом, и поставьте сверху ещё один слайд (рисунок 1). Дайте им подсохнуть 15 минут и аккуратно снимите стекло, установленное сверху. С помощью лезвия разрежьте агарозную подушечку на кусочки размером 5 мм x 5 мм непосредственно перед использованием.
2. Параллельно центрифугуйте 1 мл бактерии, извлеченных апопластом, при 12 000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре, аккуратно удалите супернатант с помощью пипетки и снова суспензуйте гранулу в 20 мкл воды для концентрации ячеек. Поместите каплю концентрированных ячеек объёмом 2 мкл на ковер 0,17 мм и накройте каплю кусочком 5 мм x 5 мм из агарозной подушечки, ранее полученной на первом этапе, как показано на рисунке 1.
3. Визуализируйте бактериальный препарат под конфокальным микроскопом (см. таблицу материалов). Для идентификации зелёных флуоресцентных бактерий используйте возбуждающий лазер с частотой 488 нм и эмиссионный фильтр диапазоном от 500 нм до 550 нм. Чтобы определить все бактерии, используйте яркое поле и объедините оба поля.
4. Обработайте конфокальные изображения с использованием фиджийского языка (см. таблицу материалов). Для этого используйте плагин MicrobeJ, чтобы определить контур бактериальной клетки и измерить интенсивность флуоресценции внутри.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого анализа рекомендуется получение изображений от изолированных бактерий (не кластеризованных).

Результаты

Рисунок 1: Схематическое изображение установки и подготовки агарной площадки.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,17 мм перекрытие			Особых требований нет.
Металлическая сетка 1,6 x 1,6 мм	Бузифу		Сетка из стекловолокна
Конические трубки объемом 50 мл	Сарштедт
Агарозе	Мерк
Конфокальный микроскоп Stellaris	Leica Microsystems
Фиджийское программное обеспечение