Модель кишечника in vitro для оценки адгезии и интернализации бактерий

Аннотация

Источник: Calatayud Arroyo, M. , и др. Оценка жизнеспособности синтетического бактериального консорциума на интерфейсе кишечника-хозяина in vitro. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео демонстрируется модель in vitro хозяина кишечника и микроба для изучения жизнеспособности бактерий. Кокультура клеток Caco-2 и HT29-MTX инкубируется с помощью бактерий, предварительно обработанных при имитации пищеварительных состояний. Целостность эпителиального барьера оценивается с помощью трансэпителиального электрического сопротивления, а для дальнейшего анализа собираются фракции из среды, растворённой слизи, лизат клеток и клеточный мусор.

Протокол

1. Сорты и условия культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Синтетическое оральное сообщество состояло из штаммов, часто встречающихся в оральном микробиоме.

1. Получите следующие штаммы из Американской коллекции типовых культур (ATCC): Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Streptococcus gordonii (ATCC 49818), Actinomyces viscosus (ATCC 15987) и Streptococcus mitis (ATCC 49456).
2. Приобрести Veillonella parvula из Института Лейбница DSMZ — Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур (DSM 2007), Streptococcus sanguinis из коллекции бактерий BCCM/LMG (LMG 14657), а также использовать штамм Streptococcus salivarius TOVE-R и Streptococcus oralis.

2. Развитие многовидового сообщества, представляющего микробиом полости рта

ПРИМЕЧАНИЕ: Создать синтетическое сообщество для моделирования потенциальной способности бактерий полости рта к эпителию кишечника in vitro . Выращивать бактерии на пластинах кровяных агаров с добавлением 5 мкг/мл гемина, 1 мкг/мл менадиона и 5% стерильной дефибринированной лошадиной крови. Вкратце:

1. Растворите 100 мг гемина в 2 мл 1 мл гидроксида натрия (NaOH) и добавьте 100 мл дистиллированной автоклавной воды. Храните в тёмном контейнере. Простерилизуйте через фильтр 0,22 мкм перед добавлением в среду.
2. Растворить 100 мг менадиона в 20 мл 96% этанола. Простерилизуйте через фильтр 0,22 мкм перед добавлением в среду.
3. Подготовьте 1 л среды для кровяного агар (см. таблицу материалов) согласно инструкциям производителя и автоклаву. Дайте остыть, прежде чем добавить конскую кровь и добавки. Перемешайте и вылейте тарелки.
4. Приготовьте модифицированный бульон для инфузии мозга и сердца (BHI). Добавьте 5 мкг/мл гемина и 1 мкг/мл менадиона после автоклава.
5. Раздайте 9 мл среды в трубках Hungate и закройте резиновой пробкой и алюминиевой крышкой. Промывайте трубки азотом/углекислым газом или_N2/CO₂ (90%/10%).
6. Возьмите 1 мл анаэробной среды с помощью шприца и поместите его в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл. Выберите отдельные колонии каждого вида бактерий, ресуспензируемые в среде и переносите обратно в анаэробно модифицированный BHI. Инкубировать 48 часов при 37 °C, за исключением S. salivarius, который должен инкубировать 24 часа.
7. При необходимости проверьте чистоту культур перед формированием синтетического сообщества. Вкратце:
   1. Извлекать ДНК из жидких культур и амплифицировать ген 16S рРНК с помощью праймеров 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) и 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT), а также следующую программу: 5 минут при 95 °C, 30 циклов при 95 °C в течение 1 минуты, 55 °C в течение 1 минуты и 72 °C 1,5 минуты, после чего следует последний этап удлинения на 5 минут при 72 °C.
   2. Очистите продукт полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью коммерческого набора (см. таблицу материалов), следуя инструкциям производителя.
   3. Проведите секвенирующую реакцию очищенных продуктов в общим объёме 10 мкл, содержащем 0,5 мкл красителя (см. Таблицу материалов), 3,2 пмоля праймера M13f (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACACAC), 2,0 мкл 5x секвенирующего буфера и 20 нг шаблона, используя коммерческую систему секвенирования с комплектом (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы выполняли эту процедуру коммерчески.
   4. Выполните поиск BLAST по всем последовательностям (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), чтобы определить ближайший известный таксон, и сравните с последовательностью исходной формы с помощью онлайн-инструмента RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) и сервиса SINA Alignment (https://www.arb-silva.de/aligner/).
8. Измерьте количество ячеек в конце инкубации с помощью потоковой цитометрии и окрашивания SYBR Green/Propidium Iodide. Разведите культуры до 10⁵ клеток ^mL-1, используя модифицированный BHI.
9. Добавьте 1 мл S. mitis в 75 мл анаэробного BHI и инкубировать до стационарной фазы (6 ч). Затем соберите по 0,75 мл каждого разбавлённого сорта и смешайте в анаэробных условиях.
10. Когда все культуры смешаны, возьмите 1 мл микрокосма и добавьте к 75 мл BHI. Инкубировать синтетическое сообщество при 10%_CO2, 10% водорода (_{H 2}), 80% N в течение 48 часов при 37 °C и 200 об/мин (см. Таблицу материалов).
11. Измерьте плотность клеток как в 2.8. прежде чем представить сообщество модели клетки. Состав сообщества можно оценить с помощью количественного ПЦР в реальном времени. Кроме того, используйте секвенирование ампликонов гена 16S рРНК для получения информации о первых присутствующих членах. Для любого протокола подтверждения идентичности используйте cDNA как шаблон для обозначения бактерии, активно транскрибующих белки, а ДНК — как шаблон для выявления наличия или отсутствия штаммов.

3. Общие практики клеточных культур

ПРИМЕЧАНИЕ: Получите клеточные линии, используемые из Европейской коллекции аутентифицированных клеточных культур (Caco-2 ECACC 86010202 и HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, Public Health England, UK). Реагенты для культивирования клеток можно приобрести (см. Таблицу материалов), если не указано иное.

1. Поддержание и передача клеточных линий Caco-2 и HT29-MTXПРИМЕЧАНИЕ: Клетки Caco-2 и HT29-MTX регулярно выращиваются в колбах для культуры тканей диаметром 25^см² , содержащих дополненную среду Dulbecco (DMEM) (Таблица 1). Клетки трипсинизируются при достижении 60–70% слияния.
   1. Удалите клеточную культурную среду из колб. Помой дважды с 5 мл PBS без кальция/магния (Ca⁺⁺/Mg⁺⁺).
   2. Добавьте 2 мл раствора трипсина с концентрацией 0,5 мг/л и 0,22 г/л этилендиамин-тетрауксусной кислоты (ЭДТА). Распределите раствор трипсина, аккуратно двигая колбу. Удалите 1,5 мл раствора трипсина и инкубуйте колбу при 37 °C в течение 10 минут.
   3. Проверьте под микроскопом, не отделены ли клетки от поверхности колбы. Инкубировать ещё 5 минут, если потребуется.
   4. Добавьте 5 мл дополнительной клеточной культуры в колбу для инактивации трипсина. Пипетты вверх и вниз, чтобы получить однородную суспензию с одной ячейкой.
   5. Немедленно возьмите аликвот 50 мкл клетки и смешайте со стерильным раствором Trypan blue 0,4% в пропорции 1:1 (v/v) для клеток Caco-2 или 1:5 v/v для HT29-MTX. Смешивайте с помощью пипетирования и загружайте в счётную камеру (см. таблицу материалов).
   6. Подсчитайте жизнеспособные клетки (белые яркие клетки) под микроскопом (см. инструкции производителя).
   7. Семена в новую колбу с плотностью 4 x 10⁵ клеток/^{см² и} 1 x 10⁴ клетки/см^² для Caco-2 и HT29-MTX соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Клетки Caco-2 дифференцируются и образуют плотные соединения после достижения слияния. Крайне важно избегать перераспределения перед трипсинизацией. Чрезмерный рост клеток в колбе может привести к отказу в отслоении клеток после трипсинизации и/или скуплении клеток. (2) Клетки HT29-MTX — это клетки, производящие слизь с высокой метаболической активностью. Эти признаки могут вызывать быстрое закисление среды клеточной культуры, особенно если клетки имеют высокую плотность. Буфер 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES) может быть добавлен в клеточную культурную среду (Таблица 1) для поддержания pH от 7 до 7,2. Если pH падает, среда может быть заменена при слиянии менее 50%. Однако, если слияние >50%, клеточную культуру необходимо разделить.

4. Сборка модели многокомпартментационной клетки, имитирующей интерфейс кишечника-хозяина и микроба

ПРИМЕЧАНИЕ: Завершить совместное выращивание в двойных камерах (диаметр 24 мм, поры 0,4 мкм; см. таблицу материалов).

1. Добавьте 1,5 мл полного клеточного культурного медиа в апикальный компартмент и 2 мл в базальную. Предварительно инкубировать в течение 20–30 минут, чтобы получить равномерное распределение суспензии клеток при посеве.
2. Трипсинизуйте клеточную культуру Caco-2 и HT29-MTX, как описано в разделе 3. Процедура трипсинизации должна быть точно соблюдена для достижения однородного распределения обеих клеточных линий в одной клеточной суспензии без сгустков.
3. Посчитайте жизнеспособные клетки, как описано в 3.1.8.
4. Отрегулируйте плотность клеток до 6,5 x 10⁴ ячейки/^см² в пропорции 90/10 клеток Caco-2/HT29-MTX.
5. Гомогенизировать суспензии клеток и добавить соответствующий объём клеток Caco-2 и HT29-MTX в заранее заполнённый стерильный контейнер с дополненными клеточными культурными средами. Удалите предварительно инкубированную среду с апикальной стороны камеры аспирацией.
6. Аккуратно перемешайте суспензию ячейки с помощью пипетирования и перенесите 1,5 мл в апикальный отсек камерных вставок. Процедура посева требует постоянной гомогенизации суспензии клетки, так как клетки склонны к осадке. В зависимости от опыта пользователя и рабочей скорости, подвеску ячейки необходимо смешивать после подачи 1–3 колодцев.
7. Плавно двигайте пластины вперёд и назад, затем справа слева направо (5–10 раз), чтобы равномерно распределять клетки в колодце. Перенесите в инкубатор и повторите движение пластин.
8. Поддерживайте совместную культуру клеток Caco-2/HT29-MTX в течение 15 дней, обновляя апикальные и базальные компартменты каждые 2 дня с помощью дополнительного DMEM. После этого среды можно заменить на дополнительный DMEM без антибиотика/антимикотического раствора.
9. Поддерживайте систему до 20–21 дня после посева, обновляя среду каждые 2 дня.
10. Измерьте целостность эпителиального барьера перед началом анализа, используя систему электрического сопротивления (см. таблицу материалов), следуя инструкциям производителя.
    1. Убедитесь, что оборудование для трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) полностью заряжено (>24 часа) перед началом измерений.
    2. Отсоедините оборудование TEER от блока питания и накройте пластиковым автоклавным пакетом. Сделайте отверстие в мешке, чтобы ввести электрод, и подключите его к входному порту счётчика. Опрыскайте 70% этанола/воды (V/V) перед тем, как вводить оборудование TEER в шкаф потока.
    3. Для дезинфекции электрода погрузите наконечники электрода в раствор этанола/воды 70% на 15 минут. Дайте высохнуть на воздухе 15 секунд. Промывайте электрод в предварительно нагретой клеточной культуре.
    4. Вынимите ячейки из инкубатора и дайте им достичь комнатной температуры внутри шкафа потока.
    5. Убедитесь, что счётчик отключён от зарядного устройства. Установите режим на Ohms и включите питание.
    6. Измеряйте сопротивление элемента, погружая электрод с коротким наконечником в вставку, а длинным — из ямы. Держите электрод под углом 90° к вставке пластины.

5. Выживаемость бактерий после экстракорпорально-желудочно-кишечных транзитных условий

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все разбавления с ультрачистой водой. Фильтруйте-стерилизуйте все растворы через фильтр 0,22 мкм и выполняйте процедуру переваривания в стерильных условиях.

1. Пероральное пищеварение:
   1. Поместить 3 мл бактериального сообщества в стерильную трубку объёмом 50 мл, смешать с 3 мл имитированной слюнной жидкости (SSF), содержащей (в ммоле ^L-1): хлорид калия (KCl), 15,1; калий дигидрогидрофосфат (KH₂PO₄), 3,7; бикарбонат натрия (_{NaHCO 3}), 6,8; гексагидрат хлорида магния [MgCl₂(H₂O₎₆], 0,5, карбонат аммония [(_{NH 4}) CO₃], 0,06; соляная кислота (HCl) — 1,1; Дигидрат хлорида кальция [CaCl₂(H₂O)₂], 0,75. Добавьте 75 U/mL α-амилазы из слюны человека типа IX-A и 2 г/л слизи из желудка свинины типа II в SSF.
   2. Инкубировать смесь в течение 2 минут при 37 °C и 100 об/мин. Возьмите образец объёмом 2 мл для экстракции ДНК и количественной оценки потоковой цитометрии (S1).
2. Желудочное пищеварение:
   1. Добавьте 4 мл имитированной желудочной жидкости (SGF), содержащей (в ммоле L-1): KCl, 6,9; KH₂PO₄, 0,9; NaHCO₃, 25; хлорид натрия (NaCl) — 47,2; MgCl₂(_{H 2}O)₆, 0,1; (_{NH 4})CO₃ — 0,5; HCl — 15,6; CaCl₂(_{H 2}O)₂, 0,075. Кроме того, в SGF содержалось 2 г/л слизи из свиного желудка типа II.
   2. Измерьте pH и отрегулируйте pH 3 с 1 M HCl, если потребуется. Инкубировать при 37 °C и 100 об/мин. Возьмите образец объёмом 2 мл (S2).
3. Пищеварение тонкой кишки:
   1. Добавьте 4 мл имитированной кишечной жидкости (SIF), содержащей (в мол L-1): KCl — 6,8; _{KH 2}PO₄, 0,8; NaHCO₃, 85; NaCl — 38,4; MgCl₂(_{H 2}O)₆, 0,33; HCl — 8,4; _{CaCl 2}(_{H 2}O)₂, 0,3, в пищеварительную трубку.
   2. При необходимости настройте pH 7 с 1 M NaOH. Инкубировать при 37 °C и 100 об/мин. Возьмите образец объёмом 2 мл (S3).

6. Способность бактериально колонизировать после экстракорпорально желудочно-кишечных транзитных условий

1. Центрифугуйте 2 мл тонкой кишки для переваривания на 10 минут при 2 650 x g.
2. Удалите супернатант и смешайте бактериальные гранулы с 5 мл дополнительного DMEM без антибиотиков и антимикотиков.
3. Окрашивайте и количественно оценивайте целые/повреждённые клетки с помощью потокового цитометра (см. Таблицу материалов).
4. Корректируйте плотность клеток до 10⁵ жизнеспособных клеток/мл, разбавляя дополненный DMEM без антибиотиков и антимикотиков.
5. Удалите апикальную среду системы трансвелла и добавьте 1,5 мл бактериальной суспензии. Совместное выращивание системы в течение 2 часов в общих условиях клеточной культуры (37 °C, влажность 95%,_CO2 5%).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это время можно продлить до 48 час, в зависимости от требуемого экспериментального протокола. Совместная культура может содержаться в другом инкубаторе, отличном от того, что используется для рутинного обслуживания клеток, чтобы избежать загрязнений.
6. Измерьте значения TEER после инкубации для оценки целостности эпителиального барьера, как описано в 4.11.
7. После завершения инкубационного времени удалите апикальные среды и соберите 0,5 мл для дальнейшего анализа (S4). Подвыборка среды может быть использована для оценки жизнеспособности клетки с помощью анализа на лактатдегидрогеназу (LDH) (см. таблицу материалов), следуя инструкциям производителя.
8. Добавьте 0,5 мл 10 мл N-ацетилцистеина в HBSS (NAC-буфер) для растворения слизи, вырабатываемой HT29-MTX, и восстановления приклеенных бактерий. Инкубировать пластины при 37 °C в течение 1 часа, под перемешиванием (135 об/мин, см. таблицу материалов).
9. Извлеките NAC-HBSS в микроцентрифугной трубке (S5) и дважды промывайте клетки с 1 мл DPBS.
10. Добавьте 0,5 мл 0,5% Triton X-100 (w/v) поверх монослой, нарушите работу ячеек пипетированием, восстанавливайте жидкость и вихрьте в течение 1 минуты. Скорость крайне важна, чтобы не повредить бактериальные клетки моющим средством.
11. Центрифугуйте клетки в течение 5 минут при 2 650 x g и разделите супернатант (S6) и гранулу (S7).

7. Анализ образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Проанализировать собранные образцы (S1-S7) для оценки жизнеспособности бактерий и потенциала адгезии к клеткам кишечника после имитации желудочно-кишечного пищеварения.

1. Жизнеспособность бактерий: Пропустите образцы S1-S5 дважды через фильтр 0,45 мкм и количественно оцените бактериальные клетки с помощью окрашивания живых/мёртвых клеток и проточной цитометрии, как указано на шаге 2.8.
2. Потенциал адгезии: Подготовьте последовательные разбавления (-1 до -8) для S1-S6 и полосы 10 мкл в кровяных агаре и модифицированных пластинах BHI. Инкубировать при 37 °C в анаэробных условиях в течение 24–48 часов. Положите тот же объём неразбавленной S7.
   1. Таксономическая идентификация приклеенных бактерий:
      1. Выберите отдельные колонии с петлёй культуры и пересуспензуйте каждую в 10 мкл воды без нуклеаз. Соберите 4 мкл этой суспензии и используйте его как шаблон для амплификации ПЦР гена 16S рРНК, используя праймеры и условия, описанные в 2.7.1.
      2. Выполните секвенирование в соответствии с протоколом в версии 2.7.3 и валидацию последовательности с помощью процедуры, включённой в 2.7.4.
3. Проводите дальнейший анализ, такой как полная экстракция ДНК, квантификация qPCR и/или секвенирование ампликонов 16S рРНК, экстракция РНК и транскриптомическое профилирование по мере необходимости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная оценка потоковой цитометрии была проведена сразу после отбора проб. В качестве контроля мембранно проницаемых клеток использовался образец, подвергшийся температуре 70 °C в течение 3 минут. Фоновый шум оценивался путём измерения с помощью проточной цитометрии пищеварительных жидкостей или образцов, полученных из модели клеточной культуры без бактерий. Каждый образец измерялся в тройном экземпляре.

 

Таблица 1: Описание клеточных линий и состава среды для поддержания клеточной культуры.

Клеточная культура	Прикрепление/Подвеска	Среда культивирования	Общие дополнения	Конкретные добавки	Время удвоения	Условия инкубации
Caco-2 (ECACC 86010202)	Приверженец	Модифицированная орлиная среда Dulbecco (DMEM) с содержанием глюкозы 4,5 г/л	Инактивированная сыворотка плода для крупного рогатого скота (10% v/v), пенициллин (100 U/mL)* Стрептомицин (0,1 мг/мл)* Амфотерицин (0,0025 мг/мл)*	Глутамакс (4 мМ) Незаменительные аминокислоты (1% В/В) Пируват (1 мМ)	65–72 ч.	Инкубатор с влажностью 95% и 10%CO2 CO2 (см. Таблицу материалов)
HT29-MTX (ECACC 12040401)	Приверженец			HEPES (1 мМ)	20–24 часа
* Антибиотики и противогрибковые средства были удалены из клеточной культуры за 2 дня до начала анализов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ШТАММЫ
Aggregatibacter actinomycetemcomitans	Коллекция американской типографической культуры	ATCC 43718
Fusobacterium nucleatum	Коллекция американской типографической культуры	ATCC 10953
Porphyromonas gingivalis	Коллекция американской типографической культуры	ATCC 33277
Prevotella intermedia	Коллекция американской типографической культуры	ATCC 25611
Streptococcus mutans	Коллекция американской типографической культуры	ATCC 25175
Streptococcus sobrinus	Коллекция американской типографической культуры	ATCC 33478
Actinomyces viscosus	Коллекция американской типографической культуры	ATCC 15987
Streptococcus slivarius TOVE-R
Streptococcus mitis	Коллекция американской типографической культуры	ATCC 49456
Streptococcus sanguinis	Коллекция бактерий BCCM/LMG	LMG 14657
Veillonella parvula	Институт Лейбница DSMZ — немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур	DSM 2007
Streptococcus gordonii	Коллекция американской типографической культуры	ATCC 49818
КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
Клетки Caco-2	Европейская коллекция аутентифицированных клеточных культур	86010202
Клетки HT29-MTX	Европейская коллекция аутентифицированных клеточных культур	12040401
РЕАГЕНТЫ И РАСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Бульон инфузии мозга и сердца (BHI)	Оксоид	CM1135
Кровавый агар 2	Оксоид	CM0055	Среда Кровавый Агар
Менадионе	Sigma	M9429
Hemin	Sigma	H9039
5% стерильная дефибринированная лошадиная кровь	E&O Laboratories Ltd,	P030
InnuPREP PCRpure Kit	Аналитик Йена	845-KS-5010250	Набор для очистки ПЦР
Big Dye	Прикладные биосистемы	4337454	Краска для секвенирования
Комплект для секвенирования циклов ABI Prism BigDye Terminator v3.1	Прикладные биосистемы	4337456
SYBR Green I	Инвитроген	S7585
Пропидиевый йодид	Инвитроген	P1304MP
Колбы T25 не покрыты, обработаны клеточной культурой, проветриваются, стерильны	VWR	734-2311
Решение трипсина-EDTA	Сигма-Олдрич	T3924-100ML
Раствор Trypan Blue 0,4%, жидкий, стерильно фильтрированный	Сигма-Олдрич	T8154
Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS)	Gibco	14190250
Среда для культуры клеток DMEM с GlutaMAX и пируватом	Жизненные технологии	31966-047
Вставки для клеток с полиэфирной мембраной Corning Transwell	Сигма-Олдрич	CLS3450-24EA
Муцин из свиного желудка типа II	Сигма-Олдрич	M2378
Инактивированная сыворотка плода крупного рогатого скота	Greiner Bio One	758093
Антибиотик-антимикотик (100X)	Gibco	15240062
Triton X 100 для молекулярной биологии	Сигма-Олдрич	T8787
DPBS без кальция, магний	Gibco	14190-250
Набор для анализа цитотоксичности LDH Pierce	Термо Фишер Сайентифик	88953
Скважина Corning HTS Transwell-24, размер пор 0,4 мкм	Корнинг Костар Корп	3450
Вода без нуклеазы	Серва-электрофорез	28539010
ОБОРУДОВАНИЕ
Улучшена камера счёта Нойбауэра	Карл Рот	T729.1
Потоковый цитометр BD Accuri C6	BD Biosciences	653118
Гомогенизатор PowerLyzer 24	MoBio	13155
Термоциклер T100	BioRad	186-1096
Система промыва	Изготовление на заказ	-
InnOva 4080 Incubator Shaker	Нью-Брансуик Сайентифик	8261-30-1007	Шейкер для версии 2.10
Инкубатор Memmert CO₂	Memmert GmbH & Co.	ICO150med
Millicell ERS (система электрического сопротивления)	EMD Millipore, Merck KGaA	MERS00002
Millipore Milli-Q академическая, ультрачистая водная система	Миллипор, Merck KGaA	-
Shaker (ROCKER 3D basics)	IKA	4000000	Шейкер для 6.10