Извлечение полной ДНК из листьев для выявления бактериальной инфекции

Аннотация

Источник: Чен, Х. и др. Специфическое и точное обнаружение патогена цитрусовых озеленения Candidatus liberibacter spp. с использованием обычной ПЦР на образцах тканей листьев цитрусовых. J. Vis. Exp .(2018)

В этом видео демонстрируется извлечение полной геномной ДНК из ткани цитрусовых листьев, инфицированной патогенной бактерией. Протокол обеспечивает надёжное извлечение ДНК для дальнейшего обнаружения патогена с ограниченным содержанием флоэмы с помощью ПЦР.

Протокол

1. Изолировать геномную ДНК из растительной ткани с помощью набора для геномной экстракции

1. Получите цитрусовую ткань, отрезая целый свежий лист цитрусового дерева с помощью чистых ножниц и положив лист в чистый пластиковый пакет для сэндвича.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пакет с тканями листьев следует как можно скорее после сбора поместить в холодильник при температуре 4 °C или на лёд в изолированной ёмкости, чтобы избежать порчи.
2. Добавьте небольшое количество жидкого азота, чтобы охладить ступку с пестиком. Пока они охлаждаются, используйте ножницы, чтобы вырезать небольшой кусочек листьев размером примерно 1 квадратный дюйм. Поместите разрезанную ткань в ступку, чтобы мгновенно заморозить. Добавьте больше жидкого азота, если нужно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированные перчатки всегда следует носить при работе с жидким азотом.
3. Быстро измельчите растительную ткань в мелкий порошок в ступке. Продолжайте измельчать, пока жидкий азот полностью не испарится и не останется мелкий зелёный порошок.
4. Кратко охладите металлическую лопатку в жидком азоте на 10–15 секунд, затем зачерпните измельченную ткань внутри раствора в микроцентрифугу объёмом 1,5 мл с помощью лопатки.
5. Добавьте 600 мкл раствора слиза ядер (см. таблицу материалов) с помощью пипетки объемом 1000 мкл. Закрутите образец в течение 1–3 секунд, затем инкубуйте в водяной бане при температуре 65 °C в течение 15 минут.
6. Добавьте 3 мкл раствора РНазы в лизат с помощью пипетки 10 мкл, переверните трубку 2–5 раз для смешивания и инкубируете при 37 °C в шкаф-инкубаторе в течение 15 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте смеси остыть до комнатной температуры, прежде чем продолжать.
7. Добавьте 200 мкл раствора для белкового осадка, проведите вихрь на высокой скорости в течение 20 секунд, затем центрифугуйте 3 минуты при 13 000 x г для получения плотной гранулы. Во время центрифугирования образца добавьте 600 мкл комнатной температуры изопропанола в свежую микроцентрифугную трубку на 1,5 мл.
8. Используя пипетку объемом 1000 мкл, аккуратно удаляйте супернатант из центрифугированного образца и переносите его в свежую микроцентрифугную пробирку объёмом 1,5 мл с изопропанолом. Теперь гранулу можно выбросить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте загрязнения супернатанда белком, оставляя над гранулой крошечное количество супернатанта.
9. Инвертируйте трубку, пока ДНК не станет видимой в виде массы нитей, затем центрифугуйте при 13 000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре.
10. Декантуйте супернатант, добавьте 600 мкл этанола 70% в гранулу, несколько раз инвертируйте трубку для промывки ДНК и центрифугуйте при 13 000 x g в течение 1 минуты.
11. Аккуратно аспирируйте этанол, оставляя свободную ДНК-гранулу, затем откройте и инвертируйте трубку, лежа на впитывающей бумаге. Сушить на воздухе при комнатной температуре 15 минут.
12. Добавьте 100 мкл раствора для регидратации ДНК в высушенную ДНК-гранулу, затем инкубируете ДНК в водяной бане при температуре 65 °C в течение 1 часа, периодически перемешивая, постукивая по трубке.
13. Поместите 1 мкл очищенной воды в микрокювет и вставьте его в спектрофотометр для использования в качестве заготовки. Вычислите концентрацию ДНК, поместив 1 мкл образца в микрокювету и вставив его в спектрофотометр. Концентрация ДНК (ng/μL) может быть вычислена как (_{A 260} -_{A 320}) × коэффициент разбавления × 50 нг/мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Образец можно хранить при 4 °C.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Набор для очистки геномной ДНК Wizard	Promega	A1120	Источник растворов для лизисирования ядер, РНаз, белковой преципитации и растворов для регидратации ДНК
Жидкий азот	Воздушные продукты	Н/Д
Настольная центрифуга 5424	Эппендорф	05-403-93
Цифровая водяная баня Isotemp 215	Фишер Сайентифик	15-462-15Q
Металлическая лопатка	Сигма-Олдрич	Z283274
Ступка с пестиком	Сигма-Олдрич	Z247464
LSE Vortex Mixer	Корнинг	6775
2-пропанол	Сигма-Олдрич	I9516
Стерильные наконечники 10 мкл	TipOne	1161-3730
Стерильные наконечники на 200 мкл	TipOne	1163-1730
Стерильные наконечники 1250 мкл	TipOne	1161-1750
Набор для пипетторов с переменным объёмом	VWR	75788-460
База Трис	Сигма-Олдрич	10708976001
Микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 мл	Термо Фишер Сайентифик	3439