$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Изолировать геномную ДНК из растительной ткани с помощью набора для геномной экстракции
- Получите цитрусовую ткань, отрезая целый свежий лист цитрусового дерева с помощью чистых ножниц и положив лист в чистый пластиковый пакет для сэндвича.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пакет с тканями листьев следует как можно скорее после сбора поместить в холодильник при температуре 4 °C или на лёд в изолированной ёмкости, чтобы избежать порчи. - Добавьте небольшое количество жидкого азота, чтобы охладить ступку с пестиком. Пока они охлаждаются, используйте ножницы, чтобы вырезать небольшой кусочек листьев размером примерно 1 квадратный дюйм. Поместите разрезанную ткань в ступку, чтобы мгновенно заморозить. Добавьте больше жидкого азота, если нужно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированные перчатки всегда следует носить при работе с жидким азотом. - Быстро измельчите растительную ткань в мелкий порошок в ступке. Продолжайте измельчать, пока жидкий азот полностью не испарится и не останется мелкий зелёный порошок.
- Кратко охладите металлическую лопатку в жидком азоте на 10–15 секунд, затем зачерпните измельченную ткань внутри раствора в микроцентрифугу объёмом 1,5 мл с помощью лопатки.
- Добавьте 600 мкл раствора слиза ядер (см. таблицу материалов) с помощью пипетки объемом 1000 мкл. Закрутите образец в течение 1–3 секунд, затем инкубуйте в водяной бане при температуре 65 °C в течение 15 минут.
- Добавьте 3 мкл раствора РНазы в лизат с помощью пипетки 10 мкл, переверните трубку 2–5 раз для смешивания и инкубируете при 37 °C в шкаф-инкубаторе в течение 15 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте смеси остыть до комнатной температуры, прежде чем продолжать. - Добавьте 200 мкл раствора для белкового осадка, проведите вихрь на высокой скорости в течение 20 секунд, затем центрифугуйте 3 минуты при 13 000 x г для получения плотной гранулы. Во время центрифугирования образца добавьте 600 мкл комнатной температуры изопропанола в свежую микроцентрифугную трубку на 1,5 мл.
- Используя пипетку объемом 1000 мкл, аккуратно удаляйте супернатант из центрифугированного образца и переносите его в свежую микроцентрифугную пробирку объёмом 1,5 мл с изопропанолом. Теперь гранулу можно выбросить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте загрязнения супернатанда белком, оставляя над гранулой крошечное количество супернатанта. - Инвертируйте трубку, пока ДНК не станет видимой в виде массы нитей, затем центрифугуйте при 13 000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре.
- Декантуйте супернатант, добавьте 600 мкл этанола 70% в гранулу, несколько раз инвертируйте трубку для промывки ДНК и центрифугуйте при 13 000 x g в течение 1 минуты.
- Аккуратно аспирируйте этанол, оставляя свободную ДНК-гранулу, затем откройте и инвертируйте трубку, лежа на впитывающей бумаге. Сушить на воздухе при комнатной температуре 15 минут.
- Добавьте 100 мкл раствора для регидратации ДНК в высушенную ДНК-гранулу, затем инкубируете ДНК в водяной бане при температуре 65 °C в течение 1 часа, периодически перемешивая, постукивая по трубке.
- Поместите 1 мкл очищенной воды в микрокювет и вставьте его в спектрофотометр для использования в качестве заготовки. Вычислите концентрацию ДНК, поместив 1 мкл образца в микрокювету и вставив его в спектрофотометр. Концентрация ДНК (ng/μL) может быть вычислена как (A 260 -A 320) × коэффициент разбавления × 50 нг/мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Образец можно хранить при 4 °C.