Производство псевдовирусов методом трансфекции плазмид в клетки человека

Аннотация

Источник: Чанг, Х., и др.Подготовка псевдотипированных вирусов гриппа птиц H5 методом трансфекции фосфатом кальция и измерение нейтрализующей активности антител. J. Vis. Exp. (2021)

В данном видео демонстрируется получение псевдовирусов гриппа в клетках человека с помощью трансфекции плазмид, опосредованной фосфатом кальция, что позволяет безопасно генерировать одноцикловые вирусные частицы для последующего использования, например, в тестах на нейтрализацию антителами в условиях уровня биобезопасности 2.

Протокол

1. Упаковка псевдовируса с помощью кальций-фосфатной трансфекции

1. Приготовьте суспензии одиночных клеток HEK293FT (9 x 10⁵ на мл) в полной среде DMEM (модифицированная иглами среда Дульбекко) (Таблица 1). Добавьте 10 мл суспензии одиночных клеток в флакон T75 и инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 °C и 5% углекислого газа (CO₂) в течение 20 ч перед трансфекцией.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать клетки HEK293FT с низким номером пассажа (<20 пассажей). Убедитесь, что монослой клеток слит на 80-90%.
2. За 2 ч до трансфекции замените среду на 10 мл свежей полной среды, содержащей хлорохин (10 µM).
3. Смешайте реагенты и плазмидную ДНК, как показано в Таблице 2 и на Рисунке 1: ddH₂O (дважды дистиллированная вода), pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ8.9, 2.5 M CaCl₂ (хлорид кальция) и 2x 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES) буфер. Аккуратно перемешайте содержимое пипеткой, поднимая и опуская жидкость 5 раз; инкубируйте смесь при комнатной температуре (RT) в течение 20 мин.
4. Перенесите смесь в среду поверх клеток и осторожно покачайте флакон. Инкубируйте клетки в клеточном инкубаторе в течение 15 ч.
5. Замените среду на 15 мл свежей полной среды DMEM. Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂ в течение 65 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среда станет светло-оранжевой или слегка желтой, и как минимум у 80% клеток должен наблюдаться цитопатический эффект (ЦПЭ) при осмотре под инвертированным световым микроскопом.
6. Соберите супернатант и центрифугируйте его при 2095 x g в течение 20 мин при 4 °C. Соберите супернатант, разлейте по аликвотам и храните при -80 °C.

Таблица 1: Состав полной среды DMEM.

Состав полной среды DMEM	Концентрация
Модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM)	1x
Фетальная бычья сыворотка	10%
Пенициллин(1 U/mL)/Стрептомицин	1 μg/ mL

Таблица 2: Система упаковки псевдовирусов.

Материалы	Концентрация	Объем
2x HEPES (pH 7.1)	--	675.0 μL
CaCl2 (2.5 M)	--	67.5 μL
ddH2O	--	529.2 μL
pCMV Δ 8.9	10 ng/μL	18.9 μL
pCMV/R-HA	100 ng/μL	27.0 μL
pCMV/R-NA	50 ng/μL	13.5 μL
pHR-Luc	10 ng/μL	18.9 μL

Результаты

Рисунок 1: Схема кальций-опосредованной трансфекции. Данная схема описывает основные этапы процедуры кальций-опосредованной трансфекции.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Хлорид кальция безводный	AMRESCO	1B10-50G	Реагент
Хлорохиндифосфат	Selleck	S4157	Реагент
Модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM)	Gibco	1210-046	Реагент
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	160-04	Реагент
HEK293FT	Gibco	R70-07	Линия клеток
HEPES СВОБОДНАЯ КИСЛОТА	AMRESCO	0511-250G	Реагент
Набор ИФА на антиген p24 ВИЧ-1	ZeptoMetrix	801	Набор реагентов
Замороженный набор для анализа люциферазы	Promega	E4530	Набор реагентов
Микроцентрифужные пробирки 1.5 mL	Thermo fisher scientific	509-GRD-Q	Расходный материал
Конические центрифужные пробирки Nunc 15 mL	Thermo fisher scientific	39650	Расходный материал
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15140-12	Реагент
Наконечники для дозатора (10 μL)	Thermo fisher scientific	TF102-10-Q	Расходный материал
Наконечники для дозатора (10 μL)	Thermo fisher scientific	TF13-10-Q	Расходный материал
Наконечники для дозатора (10 μL)	Thermo fisher scientific	TF112-10-Q	Расходный материал
Серологические пипетки (5 mL)	Thermo fisher scientific	17035N	Расходный материал
Серологические пипетки (10 mL)	Thermo fisher scientific	170356N	Расходный материал