Сайленсинг микроРНК в растениях картофеля на основе вируса X картофеля

Аннотация

Проведение анализа VbMS на основе PVX у растений картофеля. Пересадите 4-недельные растения картофеля, выращенные in vitro, в почву. Через 3–4 дня после пересадки растения подвергнут анализу VbMS. Инокулируйте растения картофеля Agrobacterium, содержащими плазмиды PVX-STTM (короткие тандемные мимики мишеней). ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа VbMS у картофеля инфильтрация, опосредованная Agrobacterium, и инокуляция методом процарапывания зубочисткой проводятся одновременно. Отоберите положительные трансформанты, содержащие векторы PVX-STTM, и инокулируйте их в 50 мл жидкой среды LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл рифампицина. Культивируйте в инкубаторе при 28 °C и 220 об/мин в течение 16 ч до достижения OD600 = 1,0. Одновременно с этим высейте положительные колонии Agrobacterium как минимум на две новые чашки с LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл рифампицина, и выращивайте при 28 °C в течение 1 дня. В качестве контроля используйте вектор PVX-LIC, а для мониторинга распространения вируса — PVX-GFP. Соберите жидкую культуру Agrobacterium путем центрифугирования при 3400 x g в течение 10 мин при комнатной температуре. Ресуспендируйте клетки Agrobacterium в равном объеме буфера для инфильтрации (10 мМ MgCl2, 10 мМ MES и 200 мкМ ацетосирингона, pH = 5,6) и доведите OD600 до 1,0. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 6 ч. Инфильтрируйте культуру Agrobacterium в абаксиальную сторону полностью развернутых листьев с помощью шприца объемом 1 мл без иглы. Одной рукой переверните и придержите лист, поддерживая листовую пластинку одним пальцем с адаксиальной стороны в месте инфильтрации. Другой рукой держите шприц перпендикулярно поверхности листа и введите культуру Agrobacterium в абаксиальную сторону пластинки. Снимите культуру Agrobacterium с чашек с LB и процарапайте поверхность стебля одного или двух первых междоузлий инфильтрированных растений картофеля с помощью зубочистки. Осторожно процарапайте эпидермис стебля. Избегайте прокалывания стебля насквозь, так как это может привести к серьезному повреждению растений. Выращивайте инфильтрированные растения в теплице при 22 °C с фотопериодом 16 ч свет / 8 ч темноты и интенсивностью освещения 120 мкмоль/м2∙с1. ПРИМЕЧАНИЕ: Фенотипы, вызванные сайленсингом миРНК, обычно проявляются через 2–4 недели после инокуляции (Рисунок 1, Рисунок 2). Появление фенотипа VbMS после инфильтрации обычно занимает 10–20 дней. Фенотип VbMS зависит от свойств конкретной миРНК и генов-мишеней, условий выращивания и сортов картофеля. Чжао, Дж., и др. Сайленсинг микроРНК на основе вируса X картофеля (VbMS) в растениях картофеля. J. Vis. Exp. (2020).

В данном видео демонстрируется использование Agrobacterium tumefaciens для доставки конструкции на основе вируса X картофеля (PVX) в растения картофеля, выращенные in vitro, для проведения вирус-индуцированного сайленсинга микроРНК (VbMS). Этот метод обеспечивает системное подавление целевой микроРНК, что позволяет исследователям изучать ее роль в развитии растений по наблюдаемым фенотипическим изменениям.

Протокол

1. Проведение VbMS-анализа на основе PVX у растений картофеля.

1. Пересадите 4-недельные растения картофеля, выращенные in vitro, в почву. Через 3–4 дня после пересадки растения будут использованы для проведения анализа VbMS.
2. Инокулируйте растения картофеля штаммом Agrobacterium, содержащим плазмиды PVX-STTM (Short Tandem Target Mimic).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении анализа VbMS на картофеле инфильтрация, опосредованная Agrobacterium, и инокуляция методом механического повреждения поверхности зубочисткой проводятся одновременно.
   1. Отоберите положительные трансформанты, содержащие векторы PVX-STTM, и инокулируйте их в 50 mL жидкой среды LB, содержащей 50 μg/mL канамицина и 50 μg/mL рифампицина. Культивируйте в инкубаторе при 28 °C и 220 rpm в течение 16 ч до достижения OD₆₀₀ = 1.0.
   2. Одновременно с этим высейте положительные колонии Agrobacterium минимум на две новые чашки с LB, содержащей 50 μg/mL канамицина и 50 μg/mL рифампицина, и культивируйте при 28 °C в течение 1 дня. В качестве контроля используйте вектор PVX-LIC, а для мониторинга распространения вируса — PVX-GFP.
   3. Соберите жидкую культуру Agrobacterium путем центрифугирования при 3,400 x g в течение 10 мин при комнатной температуре. Ресуспендируйте клетки Agrobacterium равным объемом буфера для инфильтрации (10 mM MgCl₂, 10 mM MES и 200 µM ацетосирингона, pH = 5.6) и доведите OD₆₀₀ до 1.0. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 6 ч.
   4. Проведите инфильтрацию культуры Agrobacterium в абаксиальную сторону полностью развернутых листьев с помощью шприца объемом 1 mL без иглы.
      1. Одной рукой переверните и удерживайте лист, поддерживая листовую пластинку в месте инфильтрации одним пальцем с адаксиальной стороны. Другой рукой держите шприц перпендикулярно поверхности листа и введите культуру Agrobacterium в абаксиальную сторону пластинки.
   5. Снимите культуру Agrobacterium с чашек LB и с помощью зубочистки нанесите царапины на поверхность стебля одного или двух первых междоузлий инфильтрированных растений картофеля. Осторожно повреждайте эпидермис стебля. Избегайте глубокого прокалывания стебля, так как это может привести к серьезному повреждению растений.
3. Выращивайте инфильтрированные растения в теплице при 22 °C с фотопериодом 16 ч свет/8 ч темнота и интенсивностью освещения 120 μmol/m²∙ s¹.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фенотипы, вызванные сайленсингом miRNA, обычно проявляются через 2–4 недели после инокуляции (Рисунок 1, Рисунок 2). Как правило, фенотип VbMS проявляется через 10–20 дней после инфильтрации. Фенотип VbMS зависит от свойств конкретной miRNA и целевых генов, условий выращивания и сортов картофеля.

Результаты

Рисунок 1: VbMS miR165/166 у тетраплоидного сорта картофеля Katahdin. Фенотипы растений картофеля (Katahdin), экспрессирующих контрольный вектор PVX или PVX-STTM165/166. Пурпурные стрелки указывают на эктопически образованные структуры листа в жилах...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Штаммы Agrobacterium tumefaciens: GV3101, GV2260 или EHA105.
Удобрение: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed	ICL Specialty Fertilizers, Саммервилл, Южная Каролина 29483, США	G99260
MgCl2₂	ThermoFisher, Уолтем, Массачусетс 02451, США	MFCD00149781
Вектор PVX VIGS: PVX-LIC
Почва: Metro-Mix 360	Sun Gro Horticulture, Агавам, Массачусетс 01001-2907, США	Metro-Mix 360
			Zhao et al., 2016