Подготовка криосрезов сетчатки мыши для оценки проницаемости сетчатки для аденоассоциированного вируса

Аннотация

Источник: Vacca, O., et al. Использование аденоассоциированного вируса в качестве инструмента для изучения ретинальных барьеров при заболеваниях. J. Vis. Exp. (2015)

В данном видео демонстрируется пошаговая процедура подготовки криосрезов сетчатки мыши для визуализации проницаемости аденоассоциированного вируса через поврежденные барьеры сетчатки.

Протокол

Все процедуры с использованием образцов животных были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этике работы с животными. 

1. Для получения криосрезов сетчатки (Рисунок 1) препарируйте энуклеированные глаза, удалив хрусталик и роговицу, и проведите иммерсионную фиксацию в 4% параформальдегиде в течение 1 ч.
   1. Проведите криопротекцию предварительно фиксированных глаз в 10% растворе сахарозы в течение 1 ч при комнатной температуре, затем в 20% растворе сахарозы еще в течение 1 ч при комнатной температуре. Оставьте в 30% растворе сахарозы на ночь при 4 °C для завершения криопротекции. Заморозьте и залейте глазные чашечки в смолу для заливки, например Cryo-matrix. Изготовьте криосрезы толщиной 10 µm и нанесите их на предметные стекла со специальной обработкой для замороженных срезов тканей, обеспечивающей лучшую адгезию ткани при окрашивании.
   2. Пермеабилизируйте срезы с помощью 0,1% Triton X-100 в фосфатно-солевом буфере (PBS) pH 7.4 в течение 5 мин. Промойте 2 раза в PBS и проведите блокировку в течение 1 ч при комнатной температуре в PBS с 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) и 0,1% Tween 20.

Результаты

Рисунок 1: Схематическое представление общего протокола. После получения аденоассоциированного вируса (AAV) частицы вводят в стекловидное тело или в хвостовую вену анестезированным взрослым мышам. Для мониторинга экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) выполняют снимки глазного дна с помощью камеры Micron III. Характер экспрессии GFP анализируют на криосрезах сетчатки и на препаратах сетчатки методом flatmount с помощью иммуногистохимии и конфокальной микроскопии. Прохождение AAV через гематоретинальный барьер (ГРБ) оценивают с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) образцов крови мышей после интравитреального или внутрибрюшинного введения для обнаружения последовательности GFP, которая служит индикатором присутствия частиц AAV в кровотоке.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Среда для замораживания Cryomatrix	Thermo Scientific	6769006
Адгезивные предметные стекла Superfrost plus	Thermo Scientific	10143352
Бинокулярный увеличитель SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	Зум 0.66 x 5 x Светодиоды с эпи- и диа-освещением и штативом / Диссекция сетчатки
Прямые пружинные ножницы - 8.5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	Диссекция сетчатки