Все процедуры с использованием образцов животных были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этике работы с животными. 1. Иммуногистохимия Для подготовки препаратов сетчатки методом плоского монтирования (Figure 1) зафиксируйте энуклеированные глаза в 4% параформальдегиде в течение 15 мин для облегчения диссекции. Через 15–30 мин проведите диссекцию глаз, чтобы удалить роговицу и хрусталик. Отделите сетчатку от ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и склеры, сделав разрезы вокруг переднего края сетчатки (ora serrata) и зрительного нерва. Погрузите в 4% параформальдегид еще на 30 мин для фиксации сетчатки и флуоресцентного белка в трансдуцированных клетках сетчатки (время фиксации не должно превышать 24 ч). Промойте в течение 5 мин стерильным PBS, pH 7,4. Замените фосфатно-солевой буфер (PBS) на блокирующий буфер (PBS с 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA), 2% нормальной сывороткой козы или осла, 0,5% Triton X-100) и инкубируйте в блокирующем буфере либо 4 ч при комнатной температуре, либо в течение ночи при 4 °C. Инкубируйте ткани с первичными антителами в блокирующем буфере либо 4 ч при комнатной температуре, либо в течение ночи при 4 °C. Промойте 3 раза PBS. ПРИМЕЧАНИЕ: Использовались следующие антитела: анти-ламинин (1/1000) для маркировки внутренней limiting-мембраны (ILM), анти-родопсин клон 4D2 (1/500) для маркировки палочек, анти-глутаминсинтетаза клон GS-6 (1/1500) для маркировки клеток Мюллера, лектин арахисовый агглютинин (PNA) (1/40) для маркировки колбочек. Инкубируйте ткани с вторичными антителами, конъюгированными с alexa fluor, в разведении 1:500 в блокирующем буфере в течение 1 ч (для криосрезов) или 2 ч (для плоских препаратов) при комнатной температуре в защищенном от света месте. Промойте 3 раза PBS. Сделайте разгрузочные разрезы сетчатки и зафиксируйте её методом плоского монтирования на предметное стекло слоем фоторецепторов или ганглионарных клеток сетчатки (ГКС) вверх. Добавьте водную среду для заключения, накройте покровным стеклом и храните при 4 °C. Проведите конфокальную микроскопию на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе. Получайте изображения последовательно, строка за строкой, чтобы уменьшить перекрестные помехи возбуждения и эмиссии. Определите размер шага в соответствии с теоремой отсчетов Найквиста — Шеннона. Используйте настройки экспозиции, минимизирующие количество перенасыщенных пикселей на итоговых изображениях. Обработайте 12-битные изображения в FIJI, спроецируйте Z-срезы на одну плоскость с использованием функции Z-project по максимальной интенсивности и, наконец, конвертируйте в 8-битный режим цветности RGB. Vacca, O., и др.Использование аденоассоциированного вируса в качестве инструмента для изучения ретинальных барьеров при заболеваниях. J. Vis. Exp. (2015).
В данном видео демонстрируется метод доставки генов с помощью AAV в сетчатку трансгенной мыши с последующим препарированием тканей и окрашиванием для оценки целостности внутренней limiting-мембраны.
