Получение и очистка рекомбинантных частиц вируса гепатита B

Аннотация

Источник: Nishitsuji, H., et al. Разработка репортерной системы вируса гепатита B для мониторинга ранних стадий цикла репликации. J. Vis. Exp. (2017)

В данном видео демонстрируются методы получения и очистки рекомбинантных частиц вируса гепатита B, что позволяет создавать безопасные, репликативно-дефицитные вирусные препараты для изучения ранних этапов инфекции и для высокопроизводительного скрининга противовирусных препаратов.

Протокол

1. Получение рекомбинантного HBV (вируса гепатита B), кодирующего репортерный белок

1. Подготовка клеток HepG2
   1. Приготовьте среду для культивирования клеток (модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 U/ml пенициллина, 100 µg/ml стрептомицина и 100 U/ml незаменимых аминокислот).
   2. За сутки до трансфекции высейте 4 x 10⁶ клеток HepG2 (линия клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека G2) в 10-сантиметровую чашку, покрытую коллагеном, в 10 ml среды для культивирования. Инкубируйте клетки HepG2 при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При посеве приблизительно 4 x 10⁶ клеток HepG2 в 10-сантиметровую чашку, покрытую коллагеном, в 10 ml среды, на следующий день они достигнут 70-90% конфлюэнтности.
2. Трансфекция
   1. Трансфицируйте клетки HepG2 5 µg pUC1.2HBV delta epsilon15 (плазмида репликации HBV с делецией в последовательности эпсилон) и 5 µg pUC1.2HBV/NL15, используя реагент для трансфекции согласно инструкции производителя.
   2. На следующий день удалите среду для культивирования и добавьте 10 ml свежей среды.
   3. Через одну неделю после трансфекции перенесите среду, содержащую рекомбинантный HBV, в пробирку объемом 50 ml и перейдите к шагу 1.3. В чашку с трансфицированными клетками добавьте 10 ml свежей среды для культивирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продуцирование рекомбинантного HBV поддерживается в течение 4 недель. Среду, содержащую рекомбинантный HBV, можно хранить при 4 °C в течение 1 месяца.
3. Очистка рекомбинантного HBV
   1. Удалите клеточный дебрис из среды, содержащей рекомбинантный HBV, путем центрифугирования (2,300 x g в течение 5 мин).
   2. Пропустите супернатант через мембранный фильтр с порами 0.45 µm.
   3. Добавьте к среде с рекомбинантным HBV равный объем 26% PEG/1.5 M NaCl (полиэтиленгликоль 6000: 130 г, NaCl (хлорид натрия): 49 г, 1 ml 0.5 M EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) pH 8.0 и 5 ml 1 M HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота) pH 7.6 в 500 ml) и осторожно перемешайте. Инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
   4. Центрифугируйте при 2,300 x g в течение 20 мин при 4 °C.
   5. Удалите супернатант и растворите осадок в 0.5 ml TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
   6. Удалите дебрис центрифугированием при 2,300 x g в течение 5 мин.
   7. Нанесите 0.5 ml TNE, содержащего рекомбинантный HBV, на слой 0.8 ml 20% сахарозы в TNE.
   8. Центрифугируйте при 100,000 × g в течение 3 ч при 15 °C.
   9. Удалите максимально возможный объем супернатанта и сохраните осадок. Ресуспендируйте его в 1 ml безсывороточной среды DMEM на каждые 40 ml исходной среды для культивирования.
   10. Инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
   11. Отфильтруйте через фильтр 0.45 µm. Приготовьте аликвоты по 0.5 ml и храните при -80 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: При обнаружении контаминации исходного образца вируса репортерным белком очистите вирус методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности 5-30% сахарозы в TNE при 100,000 x g в течение 2 ч или методом центрифугирования в равновесном градиенте плотности CsCl (хлорид цезия) в диапазоне 1.1-1.6 g/ml при 150,000 x g в течение 50 ч.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагент для люциферазного анализа Nano-Glo Luciferase Assay Regent	Promega	N1110
Смешанный раствор пенициллина и стрептомицина	Nacalai tesque	09367-34
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Чашка с коллагеновым покрытием, 100 мм	Iwaki	4020-010
Реагент для трансфекции Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Полиэтиленгликоль (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
Полиэтиленгликоль (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
Раствор EDTA 0.5 mol/L	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Фильтр Millex-HP, 0.45 μm, полиэфирсульфонный	Merck Millipore	SLHP033RS
Диметилсульфоксид (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
96-луночный планшет с коллагеновым покрытием	Corning	NO3585
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-
pUC1.2HBV/NL	-	-