Подготовка образцов для ПЭМ Подготовьте подложечные сетки с углеродной пленкой (никелевые), предназначенные для ПЭМ. ПРИМЕЧАНИЕ: Проконсультируйтесь с сотрудниками центра коллективного пользования относительно рекомендуемых реагентов и правил работы с ними для использования на микроскопе данного центра. Сетки следует хранить в контейнере с десикантом или в вакуумной камере для минимизации воздействия влаги. Оторвите кусочки фильтровальной бумаги размером примерно 5 см x 5 см. Подготовьте стеклянные чашки Петри и подходящие самозажимные реверсивные пинцеты, предназначенные для микроскопии. Отрежьте кусок парафиновой пленки размером примерно 2,5 см x 5 см и положите его на рабочий стол. Термическая обработка капсидов норовируса GII.4 Sydney Используйте очищенный основной капсидный белок (VP1) человеческого норовируса штамма GII.4 Sydney (номер доступа: JX459908), собранный в капсиды. ПРИМЕЧАНИЕ: Капсиды для данного исследования были предоставлены Р. Атмаром (Baylor College of Medicine, Хьюстон, Техас). Разведите капсиды в 10 мМ растворе 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES) (pH 7,4) до максимального объема 15 мкл в индивидуальных ПЦР-пробирках с крышкой. Убедитесь, что в пробирке содержится не менее 600 нг капсида. Обеспечьте наличие 600 нг капсида для каждой комбинации «обработка—лиганд». Предварительно настройте амплификатор на необходимый режим термической обработки. ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе была выбрана обработка при 68 °C в течение разного времени (от 0 до 25 мин). Предварительно настройте второй амплификатор на 4 °C для немедленного охлаждения. Поместите пробирки с раствором капсидов в амплификатор на требуемое время. Сразу после нагрева перенесите их в предварительно охлажденный до 4 °C амплификатор на 5 мин. Кратковременно центрифугируйте пробирки, чтобы все капли осели на дно. Перенесите всю каплю (около 15 мкл) раствора обработанного капсида на парафиновую пленку. Зажмите край сетки пинцетом и положите сетку углеродной стороной вниз на каплю обработанного раствора. Инкубируйте в течение 10 мин, чтобы капсиды прикрепились к сетке. В зависимости от чистоты препарата капсидов при необходимости добавьте промывочные капли 10 мМ раствора HEPES объемом 10–15 мкл, располагая их в линию за каплей обработанного капсида. Через 10 мин поднимите сетку вместе с каплей. Приложите сетку почти перпендикулярно к кусочку фильтровальной бумаги, чтобы удалить каплю. С помощью сетки поднимите каплю 10–15 мкл буфера HEPES, выдержите 30 с, затем удалите ее другим кусочком фильтровальной бумаги для промывки. Поместите каплю 2% раствора урацилацетата объемом 15 мкл на свободный участок парафиновой пленки. Поднимите каплю урацилацетата сеткой и выдержите 45 с. Удалите урацилацетат, стараясь убрать большую часть раствора. Положите сетку углеродной стороной вверх на фильтровальную бумагу, следя за тем, чтобы сетка не «прилипла» к влаге на пинцете. Поместите фильтровальную бумагу с сеткой в открытую стеклянную чашку Петри. ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте пластиковые чашки Петри, так как сетки будут электростатически притягиваться к ним и прилипнут к поверхности чашки. Повторите процедуру для всех вариантов обработки. Поместите половины чашек Петри с сетками в эксикатор на ночь для высушивания перед наблюдением с помощью ПЭМ. По вопросам наблюдения за подготовленными сетками обратитесь в микроскопический центр соответствующего учреждения. Некоторые центры позволяют пользователям пройти обучение работе на своем оборудовании. Конкретные детали настройки и наблюдения на определенном микроскопе выходят за рамки данной статьи. Мур, М. Д., и др. Альтернативные методы in vitro для определения структурной целостности вирусного капсида. J. Vis. Exp.(2017).
В данном видео демонстрируется процесс термической обработки, подготовки и визуализации очищенных вирусных капсидов с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) для выявления структурных изменений и повреждений, вызванных нагревом.
