Доставка генов в спирохетные бактерии с помощью бактериофагов

Аннотация

Источник: Эггерс, К. Х. Фаг-опосредованная генетическая манипуляция спирохетой болезни Лайма Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022). В данном видео демонстрируется трансдукция генетически модифицированных спирохет Borrelia с использованием неинфекционных бактериофагов, осажденных полиэтиленгликолем и несущих плазмиду устойчивости к канамицину. После инкубации с бактериями культуру высевают на среду с добавлением антибиотика. Выживают и образуют колонии только те клетки, которые получили плазмиду. Затем эти колонии отбирают и размножают в жидкой среде с антибиотиком для создания стабильной популяции бактерий, несущих плазмиду, для последующего использования. Eggers, C. H. Фаг-опосредованная генетическая манипуляция спирохетой возбудителем болезни Лайма Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp.. (2022).

В данном видео демонстрируется трансдукция генетически модифицированных спирохет Borrelia с использованием неинфекционных бактериофагов, осажденных полиэтиленгликолем и несущих плазмиду устойчивости к канамицину. После инкубации с бактериями культуру высевают на среду с добавлением антибиотика. Выживают и образуют колонии только те клетки, которые получили плазмиду. Затем эти колонии отбирают и экспансируют в жидкой среде, содержащей антибиотик, для создания стабильной бактериальной популяции с плазмидой для последующего использования

Протокол

1. Анализ трансдукции после осаждения бактериофага φBB-1 с помощью ПЭГ (полиэтиленгликоля)

1. Подготовьте культуры B. burgdorferi, которые будут использоваться в качестве реципиента в анализах на трансдукцию. Исходя из определенной плотности, рассчитайте объем культуры реципиента, необходимый для получения 15 mL суспензии с концентрацией 1 × 107 spirochetes·mL−1.
2. Центрифугируйте данный объем культуры при 6,000 x g в течение 10 min. Слейте супернатант и ресуспендируйте осадок в 14.5 mL свежей среды BSK (Barbour-Stoenner-Kelly).
3. Добавьте ≤500 µL образца фага, осажденного ПЭГ, в культуру клона-реципиента. Тщательно перемешайте и инкубируйте при 33 °C в течение 72-96 h.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество фага, полученного при осаждении ПЭГ, может варьироваться в зависимости от ряда факторов. Однако в 500 µL культуры индуцированного штамма B. burgdorferi CA-11.2A объемом 15 mL обычно содержится 50-1,000 жизнеспособных фагов28. Объемы полученного фага ≥500 µL отрицательно влияют на рост B. burgdorferi, вероятно, из-за увеличения соотношения SM (суспензионной среды) к BSK.
4. Проведите отбор трансдуцированных клеток путем посева на твердую фазу после смешивания с осажденным ПЭГ фагом.

2. Отбор трансдуцированных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Посев потенциальных трансдукантов на твердую фазу проводится с использованием модификации протокола в один слой. Колонии B. burgdorferi растут внутри агара, поэтому для селекции трансдукантов путем посева на твердую фазу образцы должны добавляться в среду во время заливки чашек. Данный метод также может быть эффективным для селекции трансдукантов, но для этой цели он еще не был опробован.

1. Определите количество чашек, необходимых для селекции трансдуцированных клеток, исходя из количества образцов в анализах на трансдукцию и контролей, которые будут высеяны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно на один образец отливают две чашки: одну, эквивалентную примерно 10% объема культуры, и одну, содержащую остальную часть культуры. Кроме того, отливают чашки, которые служат отрицательными контролями, чтобы индивидуально проверить, что препарат фага и/или родительские клоны, использованные в качестве донора и реципиента, не растут в присутствии антибиотика(ов), используемых при селекции. Также рекомендуется подготовить материал для посева как минимум на две дополнительные чашки. Например, если количество образцов и контролей для посева составляет восемь, приготовьте достаточное количество посевной смеси для 10 чашек.
2. Приготовьте растворы для посева, как описано ниже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем каждой чашки составит 30 mL, из которых 20 mL — это 1,5x BSK для посева и 10 mL — 2,1% агароза (соотношение 2:1). Это обеспечит в чашке конечные концентрации 1x BSK и 0,7% агарозы. Например, для 10 чашек приготовьте общий объем посевной смеси 300 mL, состоящий из 200 mL 1,5x BSK и 100 mL 2,1% агарозы.
   1. Приготовьте 1 L 1,5x BSK, используя количество каждого компонента, указанное для 1,5x BSK. Храните так же, как 1x BSK.
   2. Приготовьте 2,1% агарозу в воде и автоклавируйте. Используйте раствор агарозы свежеприготовленным или храните при комнатной температуре. Если раствор хранился при комнатной температуре, перед посевом разогрейте его в микроволновой печи с неплотно закрытой крышкой до полного расплавления.
   3. Определите объем антибиотика(ов), необходимый для достижения соответствующей концентрации, исходя из общего объема посевной смеси.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если общий объем конечного посевного раствора составляет 300 mL, смешайте 200 mL 1,5x BSK и достаточное количество антибиотика, чтобы обеспечить правильную конечную концентрацию антибиотика во всем объеме 300 mL. Если донор и реципиент в анализе на трансдукцию имеют разные гены устойчивости к антибиотикам, посевная смесь должна содержать оба антибиотика. Если осажденный ПЭГ-фаг от донора кодирует маркер устойчивости к антибиотику, а реципиент его не имеет, посевная смесь должна содержать только один антибиотик.
3. Исходя из количества отливаемых чашек, перенесите соответствующий объем 1,5x BSK и антибиотика(ов) в стерильный флакон, достаточно большой для размещения всей посевной смеси. Выдержите в водяной бане при 56 °C ≥15 мин.
4. Выдержите расплавленную агарозу из автоклава или микроволновой печи в водяной бане при 56 °C ≥15 мин.
5. После выравнивания температуры добавьте определенное количество 2,1% агарозы во флакон с 1,5x BSK (с антибиотиком) и поместите посевной раствор обратно в водяную баню при 42 °C на 10-15 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повышенные температуры могут повредить или убить спирохеты. Если используется та же водяная баня, что и выше, охладите ее до 42-45 °C перед запуском таймера выдерживания. Не выдерживайте посевной раствор при 42 °C более 20 мин, иначе он начнет затвердевать во время отливания чашек.
6. Во время выдерживания подготовьте образцы B. burgdorferi для посева. Перенесите объем, предназначенный для посева, в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 50 mL.
7. Если высеваемый объем составляет менее 1,5 mL (<5% от конечного объема чашки 30 mL), перенесите образец в новую пробирку и добавляйте посевную смесь непосредственно к образцу во время посева.
   1. Для больших объемов перенесите требуемый объем культуры в новую пробирку, затем центрифугируйте при 6,000 x g в течение 10 мин при комнатной температуре. Слейте супернатант, оставив 100-500 µL, и используйте остаток для полного ресуспендирования осадка перед посевом.
   2. Для контрольных чашек после совместного культивирования добавьте ≥10⁷ клеток донорских или реципиентных клонов в стерильные конические центрифужные пробирки объемом 50 mL. Если объем превышает 1,5 mL, центрифугируйте и ресуспендируйте осадок. Если анализ на трансдукцию проводился с использованием осажденного ПЭГ-фага, в дополнение к реципиентному клону добавьте 100-250 µL образца фага в стерильную коническую пробирку объемом 50 mL для посева.
8. После того как посевной раствор выдерживался при 42-45 °C в течение 10-15 мин, перенесите 30 mL посевного раствора в пробирку с соответствующим образцом; немедленно разлейте посевную смесь с образцом в маркированную чашку. Повторите процедуру с новой пипеткой для каждого высеваемого образца.
9. Дайте чашкам затвердеть в течение 15-20 мин, затем поместите их в инкубатор при 33 °C с добавлением 5% CO₂. Не переворачивайте чашки в течение как минимум 48 ч после отливания.
10. В зависимости от фона реципиентного клона проверьте появление колоний в агарозе на селективных чашках после 10-21 дня инкубации. Отоберите не менее 5-10 колоний, растущих на чашке в присутствии обоих антибиотиков, используя стерильную боросиликатную пипетку длиной 5,75 дюйма с хлопковой пробкой, и инокулируйте их в 1,5 mL 1x BSK с соответствующим антибиотиком(ами).
11. Выращивайте инокулированные колонии при 33 °C в течение 3-5 дней или до достижения плотности примерно 20-40 спирохет на поле зрения при 200-кратном увеличении с использованием темнопольной микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После скрининга спирохеты можно заморозить для длительного хранения при −80 °C, смешав равный объем культуры со смесью 60% глицерина и 40% 1x BSK, стерилизованной путем фильтрации через фильтр 0,22 µm.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Конические центрифужные пробирки 15 mL (полипропилен)	USA Scientific	5618-8271
Митомицин C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	ОСТОРОЖНО: потенциальный канцероген; использовать только в вытяжном шкафу
Пипетки Пастера 5.75" (с хлопковой пробкой/боросиликатное стекло/нестерильные)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	Автоклавировать перед использованием
Конические центрифужные пробирки 50 mL (полипропилен)	USA Scientific	1500-1211
Абсолютный этанол
Эритромицин	Research Products International Corp	E57000-25.0
Раствор реагента гентамицина	Gibco	15750-060
Глюкоза (декстроза безводная)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
Канамицина сульфат	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0