Лентивирусная трансдукция органоидов День 0: За два дня до трансдукции перенесите содержимое лунки площадью 0,95 см², заполненной органоидами, в новую лунку, стараясь получить примерно 50 мелких органоидов. Разделите органоиды (Рисунок 1A, B). Добавьте в среду для культивирования органоидов 10 мкМ Chir99021 и 10 мМ никотинамида для получения кистозных гиперпролиферативных крипт (Рисунок 1C). ПРИМЕЧАНИЕ: Кистозные крипты лучше всего развиваются, когда свежеразделенные органоиды выращивают в присутствии Chir99021. День 2: Соберите органоиды, перемешивая матригель и среду с помощью микронного дозатора p10 (движениями вверх-вниз), чтобы разрушить смесь. Поместите смесь в пробирку объемом 15 мл. Проведите дальнейшее разрушение, используя пастуровскую пипетку, диаметр выходного отверстия которой был уменьшен путем плавления. Центрифугируйте органоиды для получения осадка в течение 5 мин при 10 x g. ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера центрифуги используйте подходящую скорость центрифугирования. Необходимо подобрать точную скорость, при которой разрушенные органоиды отделяются от смеси. Удалите супернатант и добавьте 50 мкл предварительно подогретого 1x трипсина (аналог 0,25% трипсина). Ресуспендируйте органоиды в трипсине и инкубируйте в течение 3 мин на водяной бане при 37 °C. Инактивируйте трипсин, добавив 3,5 мл среды для культивирования клеточных линий [модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% сыворотки плода говячьего (FCS), 1% пенициллина/стрептомицина и глутамина]. Центрифугируйте в течение 5 мин при 50 x g. Удалите супернатант, оставив осадок примерно в 20 мкл среды. Перенесите органоиды в этом небольшом объеме среды в лунку планшета на 48 лунок. Добавьте лентивирус с высоким титром в среде для трансдукции, ресуспендируйте и перейдите к шагу 3.10 при низкой эффективности трансдукции. ПРИМЕЧАНИЕ: Для эффективной трансдукции обычно добавляют одну аликвоту (250 мкл) лентивируса с высоким титром в одну лунку с органоидами. Это составляет 50% всего объема лентивируса, полученного за один цикл производства. Дополнительно: для повышения эффективности трансдукции проведите спинокуляцию, поместив планшет на 48 лунок с органоидами в предварительно разогретую до 32 °C центрифугу и центрифугируя при 60 x g в течение 1 часа. Поместите смесь органоидов и вируса в культуральный инкубатор и инкубируйте в течение 1 часа при 37 °C для осуществления трансдукции. Дополнительно: для дальнейшего повышения эффективности трансдукции инкубируйте органоиды дополнительно в течение 3 часов при 37 °C в культуральном инкубаторе. Добавьте 1 мл среды для культивирования органоидов, ресуспендируйте смесь органоидов и вируса, перенесите ее в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте в микроцентрифуге в течение 5 мин при 850 x g для осаждения органоидов. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 20 мкл ледяного Matrigel. Поскольку материал затвердевает при нагревании, используйте наконечники дозатора, охлажденные путем многократного перемешивания ледяного PBS. Поместите каплю в центр лунки планшета на 48 лунок и инкубируйте в культуральном инкубаторе при 37 °C в течение 15 мин до затвердевания. Через 15 мин осторожно добавьте 250 мкл среды для культивирования органоидов с добавлением 10 мМ никотинамида, 10 мкМ Chir9021 и 10 мкМ Y27632. Мелкие фрагменты разрушенных органоидов сформируются в небольшие кистозные органоиды в течение 24 часов. День 5: Обновите среду и добавьте селективные антибиотики (для пуромицина используйте концентрацию 4 мкг/мл). День 7: Замените среду на стандартную среду для культивирования органоидов с добавлением селективного антибиотика. ПРИМЕЧАНИЕ: Почкование завершится через 2-3 недели после прекращения воздействия Chir9021. После селекции органоиды можно выращивать без селективных антибиотиков. Ван Лидт де Йоде, Й. Ф., и др. Протокол лентивирусной трансдукции и последующего анализа кишечных органоидов. J. Vis. Exp. (2015)
В данном видео описывается лентивирусная трансдукция кишечных органоидов мыши из суспензии, содержащей криптоподобные структуры. С использованием матрицы базовой мембраны в качестве каркаса и среды, дополненной факторами роста, вводятся лентивирусные векторы для обеспечения стабильной интеграции генов
