Определение активации сигнального пути SMAD с помощью двойной аденовирусной трансдукции

Аннотация

Двойная аденовирусная трансдукция живых единичных клеток Высейте 1,0–1,5 x 10⁵ клеток MDA-MB-231 в каждую лунку 12-луночного планшета в 500 мкл культуральной среды DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла), содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (конфлюэнтность клеток 35%, всего 2 лунки). Заинфицируйте клетки 75 мкл аденовирусного вектора Ad-CMV-GFP (титр = 5 x 10⁹ PFU/мл) и 7,5 мкл аденовирусного вектора Ad-CAGA12-Td-Tom (титр = 5 x 10¹⁰ PFU/мл) для достижения множественности заражения (MOI) 2500, что позволяет добиться 100% положительного результата инфекции. Сразу после инфицирования аденовирусом обработайте клетки 0,25 мкл трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) на лунку (сток 10 мг/мл, конечная концентрация 5 нг/мкл) или не обрабатывайте. Поместите планшет в инкубатор при 37 °C и 10% CO₂ на 24 ч. Визуализируйте живые клетки с помощью фазово-контрастного флуоресцентного микроскопа. Возбуждайте зеленый флуоресцентный белок (GFP) на длине волны 470 нм, а белок Td-Tomato — на 554 нм. Чэнь, Х., и др.Визуализация живых клеток при воздействии TGF-βПуть передачи сигнала Smad3 in vitro и in vivo с использованием репортерной системы на базе аденовируса. J. Vis. Exp. (2018).

В данном видео демонстрируется метод изучения активации пути SMAD в клетках рака молочной железы с помощью двойного аденовирусного заражения. Один вирус доставляет конститутивно экспрессируемый ген GFP, в то время как другой несет RFP-репортер под управлением SMAD-чувствительного промотора. При стимуляции TGF-beta белки SMAD активируются, образуя комплекс, который индуцирует экспрессию RFP. Обнаружение двойных сигналов в живых клетках подтверждает активацию пути.

Протокол

1. Двойная аденовирусная трансдукция живых одиночных клеток

1. Рассейте 1.0 - 1.5 x 10⁵ клеток MDA-MB-231 в 500 μL культуральной среды DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла), содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в каждую лунку 12-луночного планшета (конфлюэнтность клеток 35%, всего 2 лунки).
2. Инфицируйте клетки, добавив 75 μL аденовирусного вектора Ad-CMV-GFP (титр = 5 x 10⁹ PFU/mL) и 7.5 μL аденовирусного вектора Ad-CAGA12-Td-Tom (титр = 5 x 10¹⁰ PFU/mL) для достижения множественности заражения (MOI) 2 500, что позволяет обеспечить 100% эффективность инфицирования.
3. Сразу после инфицирования аденовирусом обработайте клетки трансформирующим ростом фактором-бета (TGF-β) в дозе 0.25 μL на лунку (сток 10 mg/mL, конечная концентрация 5 ng/μL) или не обрабатывайте (контроль).
4. Поместите планшет в инкубатор при 37 °C с 10% CO₂ на 24 h.
5. Проведите визуализацию живых клеток с помощью фазово-контрастного флуоресцентного микроскопа. Возбуждение зеленого флуоресцентного белка (GFP) осуществляйте на длине волны 470 nm, а белка Td-Tomato — на 554 nm.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM	ThermoFisher	1881024	Подогреть на водяной бане при 37 °C перед использованием
Фетальная бычья сыворотка	Scientifix Life	FBS500-S	Термоинактивировать перед использованием
Рекомбинантный TGF-β1 человека	PEPROTECH	100-21	Растворить в DDW для получения конечной концентрации 10 mg/mL
Фазово-контрастная флуоресцентная микроскопия	OLYMPUS	IX50
MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-26
Раствор			Состав
FBS-DMEM			5% термоинактивированной FBS; 10 μg/mL пенициллина; 100 μg/mL стрептомицина