Мультиплексная флуоресцентная визуализация вирусных нуклеиновых кислот и белков в инфицированных лимфоцитах человека

Аннотация

1. Иммуноокрашивание белков: Для маркировки интересующих белков. Слейте PBS (фосфатно-солевой буфер) и добавьте на покровное стекло 20 мкл блокирующего буфера (1% масс./об. BSA (бычий сывороточный альбумин), 10% об./об. FBS (эмбриональная телячья сыворотка) в PBS с 0,1% об./об. Tween-20 (PBST)). Инкубируйте 1 ч при комнатной температуре. Слейте блокирующий буфер и нанесите 20 мкл первичных антител, разведенных в PBST + 1% масс./об. BSA. Инкубируйте 1 ч при комнатной температуре. Дважды промойте предметное стекло PBST в течение 10 мин при комнатной температуре с встряхиванием. Нанесите выбранные вторичные антитела на 1 ч при комнатной температуре в PBST + 1% масс./об. BSA. Промойте предметное стекло PBST в течение 10 мин при комнатной температуре с встряхиванием. 2. Окрашивание ядер: Контрастное окрашивание ядер после иммуноокрашивания. Слейте PBST и нанесите DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) или выбранный краситель для ядер на 1 мин при комнатной температуре. Дважды промойте предметное стекло PBS в течение 10 мин при комнатной температуре с встряхиванием. Шах, Р., и др.Мультиплексная флуоресцентная визуализация на уровне отдельных клеток для визуализации вирусных нуклеиновых кислот и белков, а также мониторинга инфекции ВИЧ, HTLV, ВГВ, ВГС, вируса Зика и гриппа. J. Vis. Exp. (2020)

В данном видео демонстрируется одновременная визуализация ДНК, РНК и капсидного белка ВИЧ-1 в инфицированных лимфоцитах человека с использованием гибридизации разветвленной ДНК и иммунофлуоресценции, что позволяет детально анализировать стадии репликации вируса в отдельных клетках.

Протокол

1. Иммуноокрашивание белков: для маркирования интересующих белков

1. Слейте PBS (фосфатно-солевой буфер) и добавьте на покровное стекло 20 µL блокирующего буфера (1% w/v BSA (бычий сывороточный альбумин), 10% v/v FBS (эмбриональная телячья сыворотка) в PBS с 0,1% v/v Tween-20 (PBST)). Инкубируйте 1 h при RT (комнатной температуре).
2. Слейте блокирующий буфер и нанесите 20 µL первичных антител, разведенных в PBST + 1% w/v BSA. Инкубируйте 1 h при RT.
3. Дважды промойте предметное стекло PBST в течение 10 min при RT с перемешиванием.
4. Нанесите выбранные вторичные антитела на 1 h при RT в PBST + 1% w/v BSA.
5. Промойте предметное стекло PBST в течение 10 min при RT с перемешиванием.

2. Окрашивание ядер: Контрастное окрашивание ядер после иммуноокрашивания

1. Слейте PBST и нанесите DAPI (4',6-диамидино-2-фенилизоиндол) или выбранный краситель для ядер на 1 min при RT.
2. Промойте предметное стекло дважды с помощью PBS в течение 10 min при RT с встряхиванием.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Антитела к белку NS5a вируса гепатита C (HCV)	Abcam	ab1383	Мышиные моноклональные антитела; работают с генотипами ВГС 1a, 1b, 3 и 4
Моноклональное антитело к p24 ВИЧ-1	Программа реагентов по ВИЧ/СПИДу NIH	3537
Антитела к Mov10	Abcam	ab80613	Кроличьи поликлональные антитела
Бычий сывороточный альбумин			Блокирующий реагент для иммуноокрашивания
Клеточная среда с добавками			Среда, подходящая для данной модели клеток
Предметные стекла
DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол)	ACD Bio		Ядерный краситель (набор RNAscope от ACD Bio)
Фосфатно-солевой буфер Дюльбекко (1X PBS)	Gibco	14190250	Без кальция и магния
Фетальная бычья сыворотка (ФБС)			Используйте соответствующую FBS в зависимости от того, в какой сыворотке были получены вторичные антитела (например, FBS козы)
Микроскопические стекла Fisherbrand ColorFrost Plus	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	Предварительно очищенный
Предметные стекла
Tween-20			Для буфера для гибридизации ДНК и PBS-T