Очистка интасом прототипа пенистого вируса методом эксклюзионной хроматографии

Аннотация

1. Солюбилизация интасомы Подготовьте два наконечника для пипеток с широким отверстием, отрезав 2–4 мм от конца наконечника объемом 20 мкл с помощью нового лезвия бритвы или скальпеля на чистой поверхности. ПРИМЕЧАНИЕ: Эти наконечники будут использоваться на этапах 1.3 и 1.5. Извлеките диализную трубку из диализного буфера. Чтобы предотвратить разбавление образца интасомы диализным буфером, который может остаться в конце трубки возле зажима, используйте микропипетку с узким наконечником, чтобы удалить излишки буфера. Снимите зажим с одного конца диализной трубки. С помощью наконечника с широким отверстием, подготовленного на этапе 1.1, перенесите образец вместе с осадком из диализной трубки в пробирку объемом 1,5 мл на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем восстановленного материала обычно составляет около 140 мкл. Образец с осадком содержит 20 мМ NaCl; увеличьте концентрацию соли до конечного значения 320 мМ NaCl, добавив соответствующий объем стокового раствора 5 М NaCl. Например, для образца объемом 150 мкл добавьте 3,9 мкл 5 М NaCl и 1,1 мкл ddH2O для получения конечного объема 15 мкл. Перенесите контейнер со льдом и образцом в холодную комнату (4 °C). С помощью наконечника с широкого отверстия из этапа 1.1 ресуспендируйте и солюбилизируйте осадок путем пипетирования. Повторяйте процедуру каждые 20 мин в течение как минимум 1 часа. Убедитесь, что большая часть осадка перешла в раствор. ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетирование для ресуспензии осадка можно прекратить, когда станет очевидно, что количество осадка больше не заметно уменьшается между временными точками. Если вирусная ДНК (вДНК) не мечена или мечена внутренне, осадок уменьшается примерно на 90% (по результатам визуального осмотра). В случае вДНК с концевой меткой Cy5 осадок уменьшается лишь на ~20%; большая часть осадка с вДНК, имеющей концевую флуоресцентную метку, не солюбилизируется. Количество эффективно солюбилизируемого осадка варьируется и должно быть определено эмпирически. 2. Очистка интасомы Приготовьте 250 мл рабочего буфера для эксклюзионной хроматографии (SEC) (20 мМ бис-трис пропан, pH 7,5, 320 мМ NaCl, 10% глицерин). Стерилизуйте буфер с помощью фильтрующего модуля с порами 0,2 мкм и храните при 4 °C. ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы очистки проводятся в холодной комнате при 4 °C. Уравновесьте колонку для SEC со сшитым агарозовым наполнителем (диаметр = 10 мм; длина = 30 мм; объем слоя = 24 мл; объем образца = 25–50 мкл; максимальное давление = 1,5 МПа; предел исключения = 4 x 10⁷ Да; разделяет молекулярные массы от 5 до 5 00 кДа, см. таблицу материалов) рабочим буфером SEC при скорости потока 0,4 мл/мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Данный метод очистки может быть адаптирован для других колонок для эксклюзионной хроматографии, если они способны эффективно отделять фракции 30 кДа от 4 кДа, например, Superose 12 10/30 GL или Superose 6 Increase. Superose 12 10/30 GL обладает более низким разрешением, что приводит к большему перекрыванию пиков. Напротив, Superose 6 Increase обладает более высоким разрешением и обеспечивает лучшее разделение. Центрифугируйте образец интасомы в микроцентрифуге при 14 0 x g в течение 10 мин при 4 °C, чтобы осадить остатки препарата. Осторожно удалите супернатант. Внесите супернатант в петлю для ввода образца объемом 20 мкл (трубка, вмещающая ~20 мкл). Нанесите образец на колонку SEC. ПРИМЕЧАНИЕ: Меньшие объемы вводимого образца обеспечивают более высокое разрешение при SEC. Элюируйте рабочий буфером SEC объемом 25 мл и соберите 95 фракций по 270 мкл. Обратите внимание, что на хроматограмме SEC отображаются три пика A280/A260 (Рисунок 1). ПРИМЕЧАНИЕ: Первый пик должен соответствовать агрегатам (~9,0–1,5 мл элюции), за ним следует пик тетрамерной интасомы PFV (~12,0–14,75 мл элюции) и пик мономера IN PFV со свободной вДНК (~15,0–18,0 мл). Маклер, Р. М., и др.Сборка и очистка интасом прототипного пенистого вируса. J. Vis. Exp. (2018)

В данном видео демонстрируется очистка интасом прототипа пенистого вируса (PFV) из смешанной белково-ДНК суспензии с помощью экстракции солью и эксклюзионной хроматографии, что позволяет получить активные комплексы для последующего анализа.

Протокол

1. Солюбилизация интасомы

1. Подготовьте два наконечника для пипеток с широким отверстием, срезая 2-4 мм с конца наконечника объемом 20 µL с помощью нового лезвия бритвы или скальпеля на чистой поверхности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечники будут использоваться в шагах 1.3 и 1.5.
2. Извлеките диализную трубку из диализного буфера. Чтобы предотвратить разбавление образца интасомы диализным буфером, который может остаться в конце трубки возле зажима, используйте микропипетку с обычным узким наконечником, чтобы удалить излишки буфера. Снимите зажим с одного конца диализной трубки.
3. Используя наконечник с широким отверстием из шага 1.1, перенесите образец вместе с осадком из диализной трубки в пробирку объемом 1,5 мл на льду. 
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем полученного материала обычно составляет ~140 µL.
4. Образец с осадком содержит 20 mM NaCl; увеличьте концентрацию соли до конечного значения 320 mM NaCl, добавив соответствующий объем стокового раствора 5 M NaCl. Например, для образца объемом 150 µL добавьте 3,9 µL 5 M NaCl и 1,1 µL ddH₂O для получения конечного объема 15 µL. Перенесите контейнер со льдом и образцом в холодильную комнату с температурой 4 ˚C.
5. Используя наконечник с широким отверстием из шага 1.1, ресуспендируйте и растворите осадок путем пипетирования. Повторяйте процедуру каждые 20 мин в течение не менее 1 ч. Убедитесь, что большая часть осадка перешла в раствор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетирование для ресуспендирования осадка можно прекратить, когда станет заметно, что количество осадка больше существенно не уменьшается между временными точками. Если вирусная ДНК (вДНК) не мечена или мечена внутри цепи, при визуальном осмотре количество осадка уменьшается примерно на 90%. В случае вДНК с концевой меткой Cy5 количество осадка уменьшается лишь на ~20%; большая часть осадка с вДНК, имеющей концевую флуоресцентную метку, не растворится. Количество эффективно растворяемого осадка варьируется и должно определяться эмпирически.

2. Очистка интасомы

1. Приготовьте 250 mL рабочего буфера для эксклюзионной хроматографии (SEC) (20 mM Bis-tris propane, pH 7.5, 320 mM NaCl, 10% глицерина). Пропустите буфер через стерилизующий фильтр с порами 0.2-µm и храните при 4 ˚C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы очистки проводятся в холодильной комнате при 4 ˚C.
2. Уравновесьте колонку SEC с перекрестно-сшитым агарозом (диаметр = 10 mm; длина = 30 mm; объем слоя = 24 mL; объем образца = 25 - 50 µL; максимальное давление = 1.5 MPa; предел исключения = 4 x 10⁷ Da; разделение молекулярных масс от 5 до 5,00 kDa, см. Таблицу материалов), используя рабочий буфер SEC при скорости потока 0.4 mL/min.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данный метод очистки может быть адаптирован для других колонок для эксклюзионной хроматографии, если они способны эффективно отделять фракции 30 kDa от 4 kDa, например, Superose 12 10/30 GL или Superose 6 Increase. Superose 12 10/30 GL обладает более низким разрешением, что приводит к большему перекрытию пиков. Напротив, Superose 6 Increase обладает более высоким разрешением и обеспечивает лучшее разделение.
3. Центрифугируйте образец интасомы в микроцентрифуге при 14,0 x g в течение 10 min при 4 ˚C, чтобы осадить любой оставшийся осадок. Осторожно удалите супернатант. Перенесите супернатант в петлю для ввода пробы объемом 20 µL (трубка, вмещающая ~20 μL). Введите образец в колонку SEC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Меньшие объемы вводимой пробы обеспечивают более высокое разрешение при SEC.
4. Элюируйте 25 mL рабочего буфера SEC и соберите 95 фракций по 270 µL. Обратите внимание, что на хроматограмме SEC видны три пика A₂₈₀/A₂₆₀ (Рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Первый пик должен соответствовать агрегату (~9.0 - 1.5 mL элюции), за ним следует пик тетрамерной интасомы PFV (~12.0 - 14.75 mL элюции) и пик мономера PFV IN со свободной вДНК (~15.0 - 18.0 mL).

Результаты

Рисунок 1: Хроматограмма гель-фильтрации. Сборка интасомы PFV была разделена с помощью агарозной колонки для эксклюзионной хроматографии (SEC). Эта колонка позволяет разделить агрегат (1), интасому PFV, состоящую из тетрамера PFV IN и двух молекул vDNA (2), а также мономерный PFV IN и vDNA (3). В данном примере использовалась vDNA с внутренним флуоресцентным красителем Cy5, детектируемым при возбуждении 650 nm. Ось Y обозначает оптическую плотность (OD) в миллиединицах абсорбции (mAU).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ДНК-олигомеры	IDT	Поскольку исходный текст отсутствует (N/A), перевод не может быть выполнен. Пожалуйста, предоставьте текст для перевода.	Синтетические олигонуклеотиды ДНК по индивидуальному заказу
NaCl	P212121	RP-S23020
Бис-Трис-пропан,>=9,0% (титрование)	Sigma-Aldrich	B6755-500G
Глицерин	Thermo Fisher Scientific	G37-20
Наконечники для нанесения проб на гель, 1 - 200 μL	Corning	CLS4853-40EA
Лезвие бритвы; одностороннее; 10 шт./уп.; упаковка из 100 шт.	Fisher Scientific	12-640
Зажимы для диализных трубок	Spectrum Labs	132734
Диализная трубка с порогом отсечения 6-8 кДа, диаметр 10 мм	Spectrum Medical	132645
Superose 6 10/30 GL	GE Healthcare Life Sciences	17517201