Получение вирусной РНК для анализа методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР)

Аннотация

Подготовка образцов вируса для RT-qPCR (количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени) ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 1.1–1.3 следует проводить внутри бокса биологической безопасности. В частности, работа с супернатантом культуры, содержащим инфекционный вирус, должна осуществляться в условиях уровня биологической безопасности 2 (или выше). 1. Смешайте 199 мкл буфера для подготовки и 1 мкл протеиназы K, не содержащей нуклеаз. 2. Выполните серийное разведение синтезированной РНК (рибонуклеиновой кислоты) 3’-UTR (нетранслируемой области) DENV (вируса денге) в пропорции 1:10, чтобы получить стандарт РНК с концентрацией от 5 x 10⁹ до 5 x 10³ копий/мкл, используя среду для культивирования клеток (например, DMEM (модифицированная среда Игла в модификации Dulbecco), дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой и антибиотиками [DMEM/10% фетальной бычьей сыворотки]), содержащую 40 ед/мл ингибитора РНКазы. 3. Смешайте 5 мкл супернатанта культуры инфицированных DENV клеток и стандарт РНК 3’-UTR DENV с 5 мкл раствора буфера для подготовки/протеиназы K, используя 8-пробирочные ПЦР-стрипы (полимеразной цепной реакции) или 96-луночный ПЦР-планшет. В качестве контроля без матрицы (NTC) смешайте 5 мкл среды для культивирования клеток (без добавления вируса) с 5 мкл раствора буфера для подготовки/протеиназы K. 4. После кратковременного центрифугирования инкубируйте образцы в термоциклере при следующих условиях: 1 цикл (25 °C в течение 10 мин и 75 °C в течение 5 мин). ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовленные образцы можно хранить при 4 °C, если анализ методом ПЦР в реальном времени проводится в тот же день. Для длительного хранения образцы следует хранить при -80 °C. Сузуки, Y., и др.Измерение содержания РНК вируса денге в супернатанте культуры инфицированных клеток методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени. J. Vis. Exp. (2018).

В данном видео демонстрируется процедура подготовки вирусных образцов для количественного ПЦР-анализа (полимеразной цепной реакции). Вирусные образцы и стандарты РНК подвергаются серийному разведению, обрабатываются буфером с протеиназой K и инкубируются при контролируемых температурах для высвобождения РНК. Затем обработанная РНК стабилизируется и хранится для последующего количественного определения уровней вирусной РНК.

Протокол

1. Подготовка образцов вируса для RT-qPCR (количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 1.1–1.3 следует выполнять внутри бокса биологической безопасности. В частности, работа с супернатантом культур, содержащим инфекционный вирус, должна проводиться в условиях уровня биобезопасности 2 (или выше).

1. Смешайте 199 μL обрабатывающего буфера и 1 μL протеиназы K, свободной от нуклеаз.
2. Выполните серийное разведение синтезированной РНК (рибонуклеиновой кислоты) 3’-UTR (нетранслируемой области) DENV (вируса денге) в пропорции 1:10, чтобы получить стандарт РНК в концентрации от 5 x 10⁹ до 5 x 10³ копий/μL, используя среду для культивирования клеток (например, DMEM (модифицированную среду Игла в модификации Дульбекко) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и антибиотиков [DMEM/10% фетальной бычьей сыворотки]), содержащую 40 units/mL ингибитора РНказы.
3. Смешайте 5 μL супернатанта культуры клеток, инфицированных DENV, и стандарт РНК 3’-UTR DENV с 5 μL раствора обрабатывающего буфера/протеиназы K, используя 8-луночные ПЦР (полимеразной цепной реакции) стрипы или 96-луночный ПЦР-планшет. В качестве отрицательного контроля (NTC) смешайте 5 μL среды для культивирования клеток (т. е. без добавления вируса) с 5 μL раствора обрабатывающего буфера/протеиназы K.
4. После кратковременного центрифугирования инкубируйте образцы в термоциклере при следующих условиях: 1 цикл (25 °C в течение 10 min и 75 °C в течение 5 min).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обработанные образцы можно хранить при 4 °C, если анализ ПЦР в реальном времени проводится в тот же день. Для длительного хранения образцы следует хранить при -80 °C.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
SimpliAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A24811	Аналогичный амплификатор, однако условия циклов ПЦР требуют оптимизации.
Recombinant RNase Inhibitor	Takara Bio. Inc	2313A	40 units/μL
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	Можно использовать аналогичный набор для очистки РНК.
Proteinase K	Nacalai Tesque	15679-06	>600 units/mL. Можно использовать аналогичный реагент.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL	Thermo Fisher Scientific	4346907	В зависимости от прибора для ПЦР в реальном времени можно использовать аналогичный планшет или пробирки, однако условия циклов ПЦР требуют оптимизации.