Сбор частиц вируса гепатита E из клеток рака печени человека

Аннотация

Источник: Meister, T. L., et al. Модель клеточной культуры для получения стоков вируса гепатита Е с высоким титром. J. Vis. Exp. (2020).

В данном видео демонстрируется процесс выделения частиц вируса гепатита E (HEV) из трансфицированных клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека. Внеклеточные вирусные частицы собирают из фильтрованных супернатантов, а внутриклеточные частицы высвобождают путем подвергания клеток повторяющимся циклам замораживания-оттаивания. Лизат центрифугируют, а супернатант, содержащий частицы HEV, разделяют на аликвоты и хранят при ультранизкой температуре для последующего использования

Протокол

1. Подготовка клеток HepG2 для получения вируса гепатита E, полученного из клеточных культур (HEVcc)
ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание контаминации подготовку клеток, электропорацию, инфицирование, сбор и фиксацию клеток проводили в стерильных условиях в лаборатории с уровнем биобезопасности 2. Этапы инкубации клеток при 37 °C осуществляли в инкубаторе с 5% CO₂.

1. Для подготовки клеток HepG2 к продукции HEVcc (Рисунок 1) посейте клетки в полную модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM) (см. Таблицу 1) в чашку для культивирования диаметром 15 см, покрытую коллагеном (см. Таблицу 1; перед добавлением коллагена пропустите смесь стерильного фильтрованного фосфатно-солевого буфера (PBS) и уксусной кислоты через фильтр с размером пор 0,2 µm). Инкубируйте при 37 °C до достижения клетками 90% конфлюэнтности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Одной чашки диаметром 15 см с клетками при 90% конфлюэнтности достаточно для проведения до 4 электропораций.
2. Осторожно удалите среду из чашки и один раз промойте клетки 10 mL 1x PBS. Проведите трипсинизацию клеток, добавив 3 mL 0,05% трипсина-EDTA, и инкубируйте при 37 °C до полного открепления клеток. Ресуспендируйте клетки в 10 mL полной среды DMEM и перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 mL. Определите общее количество клеток.
3. Поскольку для каждой электропорации требуется 5 x 10⁶ клеток, перенесите соответствующий объем в новую пробирку объемом 50 mL и доведите общий объем минимум до 35 mL, добавив 1x PBS. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 min и осторожно удалите супернатант, не задевая осадок клеток.
4. Еще раз промойте клетки 35 mL 1x PBS, центрифугируя при 200 x g в течение 5 min. Поместите клетки на лед, не удаляя 1x PBS, чтобы поддерживать клетки в состоянии суспензии.

2. Электропорация клеток HepG2

1. Для электропорации клеток HepG2 (Рисунок 2) приготовьте 400 µL полного Cytomix на одну электропорацию, добавив к 384 µL Cytomix (см. Таблицу 1) 2 mM ATP и 5 mM глутатиона. Приготовьте раствор непосредственно перед использованием и поместите его на лед.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Критически важно правильное и быстрое выполнение следующих этапов. Поэтому убедитесь, что все подготовлено надлежащим образом.
2. Осторожно удалите 1x PBS, не потревожив осадок клеток, полученный на этапе 4.4. Ресуспендируйте 5 x 10⁶ клеток в 400 µL полного Cytomix и добавьте 5 µg RNA. Перенесите раствор в кювету 4 мм и подайте один импульс с параметрами 975 µF, 270 V в течение 20 ms с помощью системы электропорации.
   1. После электропорации как можно быстрее перенесите клетки пипеткой Пастера в 11 mL полного DMEM на одну электропорацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения успешной трансфекции RNA в клетки HepG2 будет проведен контроль трансфекции (TC). Ожидаемый уровень трансфекции составляет 40-60% ORF2-положительных клеток.
3. Перенесите 10 mL электропорированных клеток в чашку для культивирования диаметром 10 см, покрытую коллагеном. Добавьте 1.3 x 10⁵ электропорированных клеток (300 µL) в одну лунку 24-луночного микротитрационного планшета, покрытого коллагеном и содержащего покровное стекло (в дальнейшем используется в качестве контроля трансфекции). Равномерно распределите клетки и инкубируйте при 37 °C.
   1. Через 24 ч замените среду в чашке 10 см на 10 mL свежего полного DMEM. Среду в лунке контроля трансфекции не менять. Инкубируйте еще в течение 6 дней при 37 °C.

3. Сбор внутри- и внеклеточного вируса гепатита E, полученного из клеточной культуры (HEVcc)

1. Для сбора внеклеточных частиц HEVcc (Рисунок 3) профильтруйте супернатант, полученный из чашки 10 см через 6 дней, через фильтр с размером пор 0.45 µm для удаления клеточного дебриса. Храните собранные внеклеточные HEVcc при 4 °C для заражения в тот же день; в противном случае храните при -80 °C.
2. Для сбора внутриклеточных частиц HEVcc (Рисунок 3) промойте клетки 1x PBS и проведите трипсинизацию, добавив 1.5 mL 0.05% раствора трипсина и этилендиаминтетрауксусной кислоты (трипсин-EDTA). Инкубируйте при 37 °C до полного открепления клеток. Добавьте 10 mL complete DMEM, промойте чашку для открепления клеток и перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 mL. Дважды промойте клетки раствором PBS. Центрифугируйте при 200 x g в течение 5 min.
   1. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 1.6 mL complete DMEM на одну электропорацию. Перенесите клеточную суспензию в реакционную пробирку объемом 2 mL.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте бóльшие объемы, так как это значительно снизит вирусную нагрузку.
   2. Заморозьте (в жидком азоте) и разморозьте клетки. Повторите эту последовательность 3 раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не объединяйте более чем одну порцию для электропорации (1.6 mL) при проведении 3 циклов замораживания-оттаивания, так как это снизит эффективность лизиса. Не подвергайте клеточную суспензию воздействию вортекса между циклами. Обязательно размораживайте клеточную суспензию медленно (например, при комнатной температуре или на льду), чтобы максимально увеличить вирусную нагрузку.
   3. Центрифугируйте лизированные клетки на высокой скорости в течение 10 min при 10,000 x g для отделения клеточного дебриса. Перенесите супернатант в новую пробирку. Используйте супернатант для заражения; в противном случае храните при -80 °C.
   4. При необходимости сконцентрируйте внеклеточные и внутриклеточные HEVcc с помощью концентратора для увеличения вирусной нагрузки.

Таблица 1: Состав буферов.

Рабочий раствор	Концентрирование	Объем
Коллаген	40 мл	ФСБ
	40 µl	Уксусная кислота
	1 мл	Стерильный раствор коллагена R 0,4%
Cytomix	120 мМ	KCl
	0,15 мМ	CaCl22
	10 мМ	К2высокое увеличение (HPO)4 (pH 7,4)
	25 мМ	HEPES
	2 мМ	ЭГТА
полная среда DMEM	500 мл	DMEM
	5 мл	Пенициллин-стрептомицин
	5 мл	MEM NEAA (100X)
	5 мл	L-глутамин
	50 мл	Фетальная бычья сыворотка
полная среда MEM	500 мл	MEM
	5 мл	Пируват натрия
	5 мл	Гентамицин
	5 мл	MEM NEAA (100X)
	5 мл	L-глутамин
	50 мл	с ультранизким содержанием IgG

Результаты

Рисунок 1: Схематическая схема эксперимента по подготовке клеток HepG2 для получения вируса гепатита E, выращенного в культуре клеток (HEVcc).

Рисунок 2: Схематическое описание экспериментальной установки для электропорации клеток HepG2.

Рисунок 3: Схематическая установка эксперимента по сбору внутри- и внеклеточных частиц HEVcc.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0.45 µm mesh	Sarstedt	83.1826	Сбор внеклеточного вируса
MEM	gibco	31095-029	Культивирование клеток
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Культивирование клеток
Trypsin-EDTA (0.5 %)	gibco	15400054	Культивирование клеток
ultra-low IgG	gibco	1921005PJ	Культивирование клеток
Acetic acid	CarlRoth	6755.1	Рабочий раствор коллагена
ATP	Roche	11140965001	Транскрипция in vitro и электропорация
BioRender	BioRender		Создание иллюстраций
Calcium chloride	Roth	5239.2	Цитомикс
Collagen R solution 0.4 % sterile	Serva	47256.01	Рабочий раствор коллагена
DMEM	gibco	41965-039	Культивирование клеток
EGTA	Roth	3054.3	Цитомикс
GenePulser Xcell Electroporation System	BioRad	1652660	Электропорация
HEPES	Invitrogen	15630-03	Цитомикс
Di-potassium hydrogen phosphate	Roth	P749.1	Цитомикс
KCL	Roth	6781.3	Цитомикс
Potassium di-hydrogen phosphate	Roth	3904.2	Цитомикс
L-Glutamin	gibco	25030081	Культивирование клеток
L-Glutathione reduced	Sigma-Aldrich	G4251-5G	Цитомикс
MEM	gibco	31095-029	Культивирование клеток
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Культивирование клеток
Magnesium chloride	Roth	2189.2	Цитомикс
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	Определение концентрации ДНК/РНК
PBS	gibco	70011051	Культивирование клеток
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	Культивирование клеток