Очистка вируса из аллантоической жидкости эмбрионированных куриных яиц

Аннотация

Источник: Йейтс, Дж. Г. Э., и др. Получение рекомбинантного вируса болезни Ньюкасла высокого титра из аллантоисной жидкости. J. Vis. Exp. (2022)

В видео демонстрируются процессы очистки и концентрирования вирусных частиц из осветленной аллантоической жидкости, полученной из инфицированных вирусом куриных эмбрионов. Показана серия этапов фильтрации и разделения, включая глубинную фильтрацию, тангенциальную поточную фильтрацию и ультрацентрифугирование в градиенте плотности для выделения интактных вирусов. Затем фракция, обогащенная вирусом, подвергается диализу для удаления остаточных солей и компонентов градиента путем диффузии с последующим концентрированием с помощью гипертонического раствора посредством осмоса. В результате получается очищенный вирусный препарат с высоким титром, пригодный для экспериментального использования.

Протокол

1. Амплификация вируса болезни Ньюкасла (NDV) с использованием куриных эмбрионов в яйцах, свободных от специфических патогенов

1. Инокуляция эмбрионированных куриных яиц, свободных от специфических патогенов (SPF)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, для получения одной партии вируса болезни Ньюкасла (NDV) степени чистоты in vivo используют восемь дюжин SPF эмбрионированных куриных яиц. Закажите одну или две лишние дюжины яиц, чтобы компенсировать повреждения при транспортировке, а также вариабельность жизнеспособности.
   1. После получения SPF эмбрионированных куриных яиц инкубируйте их в инкубаторе при 37 °C и влажности 60% в течение 9 дней. Убедитесь, что в инкубаторе настроено автоматическое покачивание/вращение яиц каждый час.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца можно хранить при комнатной температуре до 24 ч или при 4 °C до 72 ч, однако это может снизить жизнеспособность эмбрионов.
   2. После 8–11 дней инкубации (в идеале на 9-й день) проведите просвечивание яиц для определения жизнеспособности эмбрионов. Признаками жизнеспособности эмбрионов являются сетчатая сосудистая сеть (Рисунок 1A) и движение эмбриона. Утилизируйте яйца, в которых эти признаки отсутствуют (Рисунок 1B).
   3. На жизнеспособных яйцах отметьте карандашом знаком «X» границу между воздушной камерой и эмбрионом (Рисунок 1A). Убедитесь, что место инъекции не приведет к перфорации сосудов. Верните помеченные яйца в инкубатор на время подготовки инокулята.
   4. Рассчитайте количество вируса, необходимое для инокуляции всех SPF эмбрионированных куриных яиц. Убедитесь, что каждое яйцо получает 100 бляшкообразующих единиц (PFU) вируса в объеме 100 µL; разведите вирус в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) до концентрации 1 × 10³ PFU/mL. Приготовьте дополнительно 20% инокулята, чтобы компенсировать погрешности при введении вируса.
   5. С помощью антистатической салфетки очистите верхнюю часть помеченных яиц 10% раствором йода, разведенным в 70% этаноле. Подождите примерно 1–2 минуты до высыхания раствора.
   6. Осторожно проколите скорлупу с помощью стерильного острого пинцета. Дезинфицируйте пинцет в 70% этаноле после каждого яйца.
   7. Используя шприц объемом 1 mL и иглу 25 G, введите 100 µL инокулята, приготовленного в шаге 1.1.4, в хориоаллантоическую полость (Рисунок 1C). Вводите иглу под углом почти 90° к яйцу. Введите иглу непосредственно в верхнюю часть хориоаллантоической оболочки.
   8. После инокуляции закройте место прокола лаком для ногтей и верните яйца в инкубатор. Убедитесь, что режим покачивания ВКЛЮЧЕН до истечения 24 ч после инокуляции.
   9. Проверьте жизнеспособность яиц через 24 ч после инокуляции. Отбракуйте погибшие яйца, в которых отсутствует сосудистая сеть в хориоаллантоической оболочке и движение эмбриона (Рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти яйца погибли в результате процесса инокуляции, а не из-за NDV.
   10. Верните яйца в инкубатор, выключив режим покачивания (OFF), чтобы предотвратить загрязнение аллантоической жидкости белками яйца.
   11. Проверяйте яйца каждые 12–24 ч, как описано в шаге 1.1.9, для выявления погибших эмбрионов. Яйца, погибшие спустя 24 ч после инокуляции, переместите при 4 °C для минимизации автолиза. Соберите аллантоическую жидкость в течение 2–12 ч после охлаждения.
   12. Инкубируйте яйца не менее 72 ч.
       ПРИМЕЧАНИЕ: При размножении мезогенного штамма NDV оптимальное время инкубации составляет 60–72 ч, так как длительная инкубация может затруднить процесс очистки из-за снижения прозрачности аллантоической жидкости. Эта проблема менее актуальна при размножении лентогенных штаммов NDV, поскольку они погибают гораздо медленнее.
   13. После соответствующего периода инкубации переместите оставшиеся яйца при 4 °C на 2–12 ч перед сбором аллантоической жидкости.
2. Сбор аллантоической жидкости, содержащей NDV
   1. Перенесите охлажденные яйца в бокс биологической безопасности. Очистите верхнюю часть яиц 70% этанолом.
   2. Используйте стерильный пинцет и хирургические ножницы, чтобы вскрыть апикальную сторону яйца в области воздушной камеры.
   3. Удалите скорлупу, чтобы обнажить хориоаллантоическую оболочку (Рисунок 1D).
   4. Осторожно проколите оболочку и отогните ее, чтобы открыть аллантоическую полость (Рисунок 1E). Следите за тем, чтобы случайно не проколоть желточный мешок, так как это испортит яйцо.
   5. С помощью тупого пинцета захватите эмбрион и вскройте эмбриональный мешок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкость внутри эмбрионального мешка также содержит NDV.
   6. Прижмите эмбрион пинцетом и соберите аллантоическую жидкость с помощью серологической пипетки объемом 10 mL.
   7. Храните аллантоическую жидкость на льду в конических пробирках объемом 15 mL до этапа осветления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если аллантоическая жидкость имеет желтый цвет, значит, желточный мешок был поврежден, и такую жидкость следует утилизировать.
   8. Центрифугируйте конические пробирки с аллантоической жидкостью при 1,500 × g в течение 10 мин при 4 °C.
   9. Контрольная точка: Разлейте осветленную аллантоическую жидкость по коническим пробиркам объемом 50 mL и храните их при -80 °C для длительного хранения (например, от нескольких недель до нескольких месяцев), добавив в жидкость сахарозу до конечной концентрации 5% для защиты вируса от резкого воздействия замораживания-оттаивания. В качестве альтернативы, для краткосрочного хранения (например, 1–3 дня) добавьте в аллантоическую жидкость сахарозу (конечная 5%) или 3× маннит-лизиновый (ML) буфер (15% маннита, 3% лизина) до получения конечной концентрации 1× (5% маннита, 1% лизина) перед хранением при 4 °C.

2. Очистка NDV из аллантоисной жидкости

1. Глубинная фильтрация аллантоической жидкости
   1. Храните осветленную аллантоическую жидкость при -80 °C и разморозьте ее при 4 °C накануне очистки.
   2. В шкафу биологической безопасности установите трубки и перистальтический насос, как показано на рисунке 2.
   3. Если это еще не было сделано, смешайте аллантоическую жидкость с 3× буфером ML до конечной концентрации 1×.
   4. Перед присоединением глубинного фильтра стерилизуйте трубки, пропустив через систему в емкость для отходов 50 mL 0,5 M гидроксида натрия (NaOH).
   5. Промойте трубки, пропустив через систему в емкость для отходов 100 mL стерильной воды степени чистоты «для молекулярной биологии».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку NaOH инактивирует NDV, важно тщательно промыть линии перед введением содержащей вирус аллантоической жидкости.
   6. Подготовьте систему, пропустив через нее 50 mL PBS, остановив насос, когда в трубке останется примерно 5 mL PBS.
   7. Присоедините к трубкам глубинный фильтр с номинальным размером пор 1-3 µM и снимите вторую крышку с апикальной стороны глубинного фильтра для вентиляции фильтра. Начните пропускать через систему еще 50 mL PBS.
   8. Как только PBS начнет вытекать через вентиляционное отверстие в верхней части фильтра, закройте порт и продолжайте пропускать PBS через линии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое количество пузырьков воздуха допустимо, но при наличии большого количества воздуха потребуется повторная вентиляция фильтра, как описано в шагах 2.1.7 и 2.1.8.
   9. Остановите насос, когда в трубке останется примерно 5 mL PBS.
   10. Замените емкость для отходов новой стерильной емкостью для сбора и начните пропускать аллантоическую жидкость через глубинный фильтр.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Давление не должно превышать 10 psi, так как это приводит к разрушению вируса (сдвиговому стрессу). Давлением можно управлять, уменьшая или увеличивая скорость потока насоса. Если давление начинает превышать 10 psi и скорость потока больше невозможно снизить, следует использовать новый глубинный фильтр. В этом случае перед возобновлением потока аллантоической жидкости необходимо выполнить шаги 2.1.6–2.1.8.
   11. После того как вся аллантоическая жидкость пройдет через фильтр, пропустите через линии 50 mL 1× буфера ML для максимального извлечения вируса.
   12. Собирайте жидкость до полного осушения линий. Храните вирус в течение ночи или до 36 ч при 4 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: После глубинной фильтрации вируса следует продолжить процесс очистки в течение 36 ч после завершения фильтрации.
   13. Отсоедините глубинный фильтр и продезинфицируйте трубки, пропустив через систему 100 mL 0,5 M NaOH и отбеливателя в концентрации 400 частей на миллион (ppm), предварительно нагретых до 42 °C, перед хранением в 0,5 M NaOH.
2. Тангенциальная фильтрация для концентрирования NDV
   1. Соберите компоненты кассеты, как показано на рисунке 3A, в шкафу биологической безопасности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коллектор и торцевая пластина перед использованием должны быть вымыты с моющим средством и высушены. Силиконовые прокладки многоразовые и должны храниться в 0,5 M NaOH вместе с кассетой.
   2. Настройте систему тангенциальной фильтрации (TFF) (также известную как фильтрация в поперечном потоке) в «открытой» конфигурации (рисунок 3B).
      1. При первом использовании кассеты соберите TFF-кассету в конфигурации элюции и промойте 100 mL стерильной воды степени чистоты «для молекулярной биологии» (рисунок 3C).
      2. Когда в резервуаре останется всего 5 mL воды, приостановите работу насоса и измените настройку системы TFF на закрытую конфигурацию (рисунок 3D).
      3. Добавьте в резервуар 100 mL 0,5 M NaOH и отбеливателя 400 ppm, предварительно нагретых до 42 °C, и проциркулируйте через систему в течение 30–60 мин.
      4. Приостановите поток и верните систему TFF в настройку элюции, возобновив поток для вымывания чистящего раствора.
      5. Когда в резервуаре останется примерно 5 mL, приостановите работу насоса и добавьте 100 mL стерильной воды степени чистоты «для молекулярной биологии» для промывки системы.
      6. Когда в резервуаре останется примерно 5 mL, приостановите работу насоса и переведите систему TFF в открытую конфигурацию (рисунок 3B). Перейдите к шагу 2.2.3.
   3. Стерилизуйте кассету и трубки, пропустив через систему 100 mL 0,5 M NaOH с помощью перистальтического насоса. Убедитесь, что давление не превышает 30 psi для сохранения целостности кассеты.
   4. Приостановите работу насоса, когда в резервуаре останется примерно 5 mL 0,5 M NaOH.
   5. Добавьте в резервуар 100 mL стерильной воды степени чистоты «для молекулярной биологии» и возобновите пропуск жидкости через кассету. Встряхните резервуар, чтобы смыть весь NaOH со стенок резервуара во избежание инактивации вируса. Повторите шаг промывки резервуара.
   6. Когда в резервуаре останется примерно 5 mL стерильной воды степени чистоты «для молекулярной биологии», приостановите работу насоса.
   7. Добавьте в резервуар 100 mL PBS, встряхивая, чтобы смыть стерильную воду степени чистоты «для молекулярной биологии» со стенок. Возобновите поток жидкости через кассету.
   8. Когда в резервуаре останется примерно 5 mL, приостановите работу насоса, добавьте в резервуар аллантоическую жидкость, прошедшую глубинную фильтрацию, и возобновите работу насоса.
   9. Следите за манометром 1 (рисунок 3B), чтобы давление не превышало 10 psi для предотвращения разрушения вируса. Используйте комбинацию скорости перистальтического насоса и C-образных зажимов для увеличения элюции в отходы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сочетание скорости перистальтического насоса и C-образных зажимов приведет к повышению давления.
   10. Когда в резервуаре останется 50–100 mL аллантоической жидкости, приостановите работу насоса для проведения обмена буфера, добавив 150–200 mL 1× буфера ML.
   11. Возобновите работу насоса, снова контролируя манометр 1 (рисунок 3B), чтобы давление не превышало 10 psi.
   12. Когда в резервуаре останется 5–10 mL, приостановите работу насоса.
   13. С помощью двух C-образных зажимов перекройте две линии отходов, как показано на рисунке 3C.
   14. Отсоедините линию ретентата, подающую жидкость в резервуар, и вставьте ее в коническую пробирку объемом 50 mL (рисунок 3C).
   15. Возобновите работу насоса, приостановив ее, когда в резервуаре останется несколько капель жидкости.
   16. Снимите C-образные зажимы с линий отходов и снова подсоедините линию подачи ретентата к резервуару (рисунок 3B).
   17. Добавьте 20–25 mL 1× буфера ML и возобновите работу насоса, пока в резервуаре не останется примерно 5 mL.
   18. Повторите шаги 2.2.13–2.2.16.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для увеличения выхода вируса можно провести 3-ю элюцию, повторив шаги 2.2.17 и 2.2.13–2.2.16. Однако большая часть вируса содержится в первых двух элюциях.
   19. После завершения элюций поместите вирус на лед или при 4 °C.
   20. Для очистки линий настройте систему в виде замкнутого контура (рисунок 3D), при котором линии отходов подают жидкость обратно в резервуар, как показано на рисунке 3D.
   21. Приступите к очистке системы, добавив 250 mL 0,5 M NaOH и отбеливателя 400 ppm, предварительно нагретых до 42 °C.
   22. Пропускайте чистящий раствор через систему в течение ночи.
       ПРИМЕЧАНИЕ: При рециркуляции чистящего раствора и работе насоса со скоростью 50 mL/мин должно наблюдаться давление около 5 psi. Если давление превышает это значение, кассета загрязнена; в этом случае чистящий раствор следует заменить и повторить процесс.
   23. Вымойте чистящий раствор, направив обе линии отходов и линию ретентата в емкость для отходов.
   24. Добавьте в резервуар 400–500 mL стерильной воды и пропустите ее через систему в емкости для отходов.
   25. Когда в резервуаре останется примерно 5 mL, приостановите работу насоса и добавьте в резервуар 100–200 mL 0,5 M NaOH, встряхивая раствор для промывки емкости резервуара.
   26. Когда резервуар будет почти пуст, повторите шаг 2.2.23 еще два раза.
   27. Разберите установку TFF, храня TFF-кассету и прокладки в небольшом объеме 0,5 M NaOH в герметичном пластиковом пакете при 4 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Трубки можно хранить при комнатной температуре, погрузив их в 0,5 M NaOH.
3. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности иодиксанола
   1. Включите ультрацентрифугу и установите предварительное охлаждение до 4 °C. Также предварительно охладите необходимый ротор до 4 °C (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Роторы следует хранить при 4 °C.
   2. Используйте стоковый 60% раствор иодиксанола (концентрация на момент покупки) для приготовления 40%, 20% и 10% растворов иодиксанола путем разбавления PBS и 3× буфером ML до конечной концентрации буфера ML 1×.
   3. В ультрацентрифужную пробирку объемом 13,2 mL с открытым верхом и тонкими стенками последовательно наслоите по 0,5 mL, 2,5 mL и 2,5 mL 40%, 20% и 10% растворов иодиксанола соответственно (рисунок 4A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наклон пробирки ультрацентрифуги на бок и медленное выдавливание раствора значительно снизят риск смешивания двух слоев градиента. Разделение каждого слоя должно быть очевидным, с видимым «ореолом» между каждым слоем градиента.
   4. С помощью маркера отметьте границы различных слоев градиента.
   5. Наслоите 6–6,5 mL элюированного вируса, полученного в ходе процедуры TFF, поверх градиента плотности. Добавляйте вирус осторожно, как описано в шаге 2.3.3, чтобы не нарушить градиент плотности.
   6. Поместите ультрацентрифужные пробирки в адаптеры для ротора с качающимися стаканами (см. Таблицу материалов), используя весы с открытой платформой для балансировки адаптеров с точностью до 0,01 g. Для компенсации разницы в весе используйте PBS или дополнительный элюент вируса.
   7. После балансировки пробирок закройте их крышками и поместите в ротор.
   8. Центрифугируйте в течение 1,5 ч при 125 000 × g при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать в ночном режиме, если ультрацентрифуга оснащена функцией отложенного старта.
   9. После ультрацентрифугирования извлеките пробирки с помощью стерильного пинцета. Найдите целевую полосу — широкую полосу между градиентами 10% и 20% (рисунок 4B).
   10. Подвесьте пробирку над стаканом с помощью штатива.
   11. Присоедините иглу 18 G × 1,5 дюйма к шприцу объемом 5 mL и проколите стенку ультрацентрифужной пробирки.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Прокол следует делать чуть ниже целевой полосы, направляя иглу под углом вверх срезом вверх так, чтобы она попала в целевую полосу.
   12. Медленно выдвигайте поршень, чтобы извлечь целевую полосу.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Перемещайте иглу внутри целевой полосы, чтобы извлечь максимальное количество вируса. Следите за тем, чтобы другие полосы или частицы мусора не смешивались с целевой полосой, и избегайте забора избыточного раствора, так как это приведет к необходимости использования большего количества диализных кассет.
   13. После извлечения целевой полосы выньте иглу и дайте оставшемуся раствору стечь в стакан для отходов. Перенесите целевую полосу в коническую пробирку объемом 50 mL, пока не будут извлечены все полосы из всех остальных ультрацентрифужных пробирок.
   14. Повторяйте шаги 2.3.10–2.3.13, пока все целевые полосы не будут извлечены из всех ультрацентрифужных пробирок.
   15. Альтернативный способ извлечения целевых полос, описанный в шагах 2.3.10–2.3.13
       1. Медленно удалите жидкость, находящуюся над целевой полосой, с помощью пипетки. Дойдя до целевой полосы, извлеките ее пипеткой и поместите вирус в коническую пробирку объемом 50 mL.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет повторно использовать ультрацентрифужные пробирки.
4. Удаление иодиксанола из раствора вируса
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полоса, содержащая NDV, появляется при плотности иодиксанола от 15% до 16%. Концентрацию иодиксанола в растворе можно определить, измеряя абсорбцию при 340 nm относительно стандартной кривой. Этот шаг можно пропустить, так как при введении мышам C57BL/6 растворов иодиксанола такой концентрации не наблюдалось побочных эффектов или острой токсичности.
   1. Предварительно смочите диализную кассету объемом 0,5–3 mL с порогом отсечения по молекулярной массе 10 kDa, погрузив ее в PBS на 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диализная мембрана должна измениться с гладкой на сморщенную или бугристую. Если объем извлеченного вируса превышает 10 mL, следует использовать две диализные кассеты по 0,5–3 mL или одну кассету объемом 5–12 mL.
   2. При необходимости используйте шприц объемом 5 или 10 mL и тупоконечную иглу 18 G × 1,5 дюйма для сбора вируса из конической пробирки объемом 50 mL.
   3. С помощью шприца введите вирус в диализную кассету, стараясь не проколоть мембрану.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диализную кассету можно вращать, чтобы изменить положение воздушного пузыря. Воздушный пузырь должен быть удален перед извлечением иглы из кассеты.
   4. Наполните стакан объемом 1 L стерильным 1× PBS, поместите внутрь магнитный якорь и диализную кассету, затем накройте. Инкубируйте при 4 °C при осторожном перемешивании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте экструдированный пенополистирол и резинку, чтобы закрепить диализную кассету так, чтобы она плавала в PBS. Кассета может немного набухнуть из-за буфера ML.
   5. Через 1–2 ч замените раствор на свежий 1× PBS и продолжайте инкубацию при 4 °C еще в течение 8–10 ч при слабом перемешивании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это также можно сделать в ночном режиме.
   6. Еще раз замените раствор на свежий 1× PBS, инкубируя при комнатной температуре в течение 1–2 ч.
5. Концентрирование раствора вируса
   1. Извлеките диализную кассету из диализного буфера (рисунок 4C) и поместите ее в небольшой герметичный пластиковый пакет. Добавьте 15–25 mL 40% 20 000 MW полиэтиленгликоля так, чтобы диализная кассета была полностью погружена.
   2. Инкубируйте при комнатной температуре в режиме качания. Периодически проверяйте объем вируса в кассете с помощью шприца объемом 5 или 10 mL и тупоконечной иглы 18 G × 1,5 дюйма.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для концентрирования вируса, будет зависеть от начального и желаемого конечного объемов. Обычно желаемый конечный объем составляет от 1 до 1,5 mL независимо от начального объема аллантоической жидкости. При проверке объема будьте осторожны и не используйте один и тот же порт, так как это нарушит целостность порта и может привести к смешиванию раствора полиэтиленгликоля с вирусом.
   3. Перед извлечением концентрированного вируса из диализной кассеты кратко промойте кассету в 1× PBS и заполните тупоконечную иглу 18 G × 1,5 дюйма воздухом.
   4. Вставьте заполненный воздухом шприц в диализную кассету и нажмите на поршень. Поверните устройство так, чтобы концентрированный вирус можно было извлечь, не выпуская введенный воздух.
   5. Перенесите концентрированный вирус в коническую пробирку объемом 50 mL, отметив объем.
   6. С помощью того же шприца и иглы введите в диализную кассету соответствующее количество 60% сахарозы так, чтобы в сочетании с ранее извлеченным вирусом ее конечная концентрация составила 5% сахарозы.
   7. Аккуратно помассируйте мембрану пальцами в перчатках, чтобы удалить остатки вируса, которые могли прилипнуть к мембране, стараясь не повредить ее. Удалите часть лишнего воздуха из диализной кассеты, чтобы облегчить процесс извлечения.
   8. Объедините эту промывочную порцию с вирусом, уже находящимся в конической пробирке объемом 50 mL.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь вирус находится в 5% сахарозе и готов к разливу в аликвоты по 20 µL, 50 µL, 100 µL или 200 µL и хранению при -80 °C. В качестве альтернативы для длительного хранения NDV может быть лиофилизирован и храниться при 4 °C, как описано в разделе 2.6.

Результаты

Рисунок 1: Инфицирование и сбор NDV из эмбрионированных куриных яиц, полученных от родительского стада, свободного от специфических патогенов. (A) После 9 дней инкубации, помимо движений эмбриона, должна быть видна сетчатая сеть сосудов (стрелки). «X» обозначает границу между хориоаллантоической мембраной и воздушной камерой, где должно быть сделано отверстие для инокуляции яйца. (B) Изображение погибшего эмбриона. Обратите внимание на отсутствие сетчатой сети сосудов. Также будет наблюдаться отсутствие движений эмбриона. (C) Схема компонентов эмбрионированного куриного яйца с указанием расположения воздушной камеры, желточного мешка, амниотического мешка, хориоаллантоической мембраны и аллантоической жидкости. (D) Удаление скорлупы для обнажения хориоаллантоической мембраны. (E) Иллюстрация того, как должны выглядеть аллантоическая жидкость и эмбрион после вскрытия хориоаллантоической мембраны. Сокращение: NDV = вирус болезни Ньюкасла.

Рисунок 2: Схема общего устройства аппарата, используемого для глубинной фильтрации. Убедитесь, что манометр установлен перед глубинным фильтром.

Рисунок 3: Схема установки тангенциальной поточной фильтрации в различных конфигурациях. Стрелками показано направление потока жидкости. (A) Иллюстрация сборки кассеты TFF. (B) Схема системы TFF в «открытой» конфигурации, используемой при очистке и концентрировании жидкости. (C) Схема установки TFF при элюции жидкости из системы, используемая при элюции вируса и промывочного раствора. (D) Схема системы TFF в «закрытой» конфигурации, которая используется при очистке системы TFF. Сокращение: TFF = тангенциальная поточная фильтрация.

Рисунок 4: Ультрацентрифугирование в градиенте плотности и диализ сконцентрированного вируса после TFF. (A) Схема состава градиента плотности иодиксанола. (B) Характер распределения вирусных полос после ультрацентрифугирования вируса, полученного с использованием буфера ML в процессе очистки. Основная полоса, содержащая вирус, отмечена черным овалом. (C) Типичный размер диализного кассетного модуля, в который было загружено 10 mL вируса, подготовленного с помощью градиента иодиксанола, по окончании процедуры диализа. Сокращения: TFF = тангенциальная фильтрация; ML = маннит-лизин.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шприц с конусом Slip-Tip, 1 mL	BD	309659
Шприц Luer-Lok, 10 mL	BD	302995
10% раствор повидон-йода	LORIS	109-08
Конические пробирки, 15 mL	Thermo-Fisher	14955240
Игла тупоконечная для заполнения, 18G x 1 1/2 in	BD	305180
Игла Precision Glide, 18G x 1 1/2 in	BD	305196
Игла, 25 G x 5/8 in	BD	305122
Шприц Luer-Lok, 5 mL	BD	309646
Уксусная кислота, ледяная	Thermo-Fisher	A38-212
Агароза	Froggabio	A87-500G
Alexa-Fluor 488 козьи антитела против мышиных	Invitrogen	A11001
Центрифуга Allegra X-14	Beckman Coulter	B08861
Персульфат аммония	BioRad	161-0700
Отбеливатель (5%)	Thermo-Fisher	36-102-0599
Пинцет с широкими незазубренными концами	Thermo-Fisher	09-753-50
Бромфеноловый синий	Sigma-Aldrich	114405-25G
Держатель кассеты Centramate	PALL	CM018V
ChemiDoc XRS+	BioRad	1708265
Цифровой инкубатор для яиц Digital 1502 Sportsman	Berry Hill	1502W
D-маннит	Sigma-Aldrich	M4125-500G
Овоскоп	Berry Hill	A46
Этанол (70%)	Thermo-Fisher	BP82031GAL
Тройники с внутренней резьбой, нейлон, 1/8 in NPT(F)	Cole-Parmer	06349-50
Комплект для контроля влажности	Berry Hill	3030
Иодиксанол	Sigma-Aldrich	D1556	60% (w/v) водный раствор иодиксанола (стерильный)
L-лизин моногидрохлорид	Sigma-Aldrich	62929-100G-F
Переходники Luer-Lok с внутренней и внешней резьбой 1/8 in NPT	Cole-Parmer	41507-44
Цифровой привод Masterflex L/S	Cole-Parmer	RK-07522-20	Перистальтический насос с цифровым дисплеем
Головка насоса Masterflex L/S Easy Load для прецизионных трубок	Cole-Parmer	RK-07514-10
Силиконовые трубки Masterflex (платиновое отверждение) L/S 16	Cole-Parmer	96420-16	Силикон BioPharm с платиновым отверждением
Мембранная кассета Omega Membrane LV Centramate, 100K	PALL	OS100T02
Ультрацентрифуга Optima XE-90	Beckman Coulter	A94471
10X раствор PBS	Thermo-Fisher	BP399-20
Полиэтиленгликоль, средняя Mn 20,000	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Диализная кассета Slide-a-lyzer (повышенной прочности), 10,000 MWCO 0.5-3 mL	Thermo-Fisher	66380
Гидроксид натрия (гранулы)	Thermo-Fisher	S318-10
Яйца, свободные от специфических патогенов	CFIA	NA	Поставщик зависит от региона
Сахароза	Thermo-Fisher	S5-3
Глубинный фильтр Supracap 50	PALL	SC050V100P
Хирургические ножницы	Thermo-Fisher	08-951-5
Ротор Sw41Ti	Beckman Coulter	331362	Используется в шагах протокола 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
Ротор SX4750	Beckman Coulter	369702
Адаптер SxX4750 для пробирок с коническим дном	Beckman Coulter	359472
Центрифужные пробирки Ultraclear с тонкими стенками (9/16 in x 3 1/2 in)	Beckman Coulter	344059
Винтовой зажим для трубок	PALL	88216
Универсальные манометры	Cole-Parmer	68355-06