Все процедуры по сбору образцов были выполнены в соответствии с рекомендациями институционального наблюдательного совета (IRB) института. 1. Трансдукция вирусом Сендай Трансдукция (день 0) Соберите клетки крови, перенесите их в коническую пробирку объемом 15 мл и подсчитайте их количество с помощью гемоцитометра. Подготовьте 3 x 10⁵ клеток для одной трансдукции и центрифугируйте их при 515 x g в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Удалите супернатант с помощью аспиратора и ресуспендируйте клетки в 0,5 мл среды для клеток крови. Перенесите клетки в лунку ненанесенного 24-луночного планшета. Разморозьте смесь вируса Сендай на льду и добавьте ее к суспендированным клеткам. Добавьте вирус Сендай в соответствии с рекомендациями производителя. Герметизируйте планшет с помощью sealing-пленки и центрифугируйте его при 1 150 x g в течение 30 мин при 30 °C. После центрифугирования инкубируйте клетки при 37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение ночи (O/N). Перенос клеток на фидерный матрикс (день 1) На следующий день покройте 24-луночный планшет витронектином. Разведите раствор витронектина в PBS до конечной концентрации 5 мкг/мл. Добавьте 1 мл витронектина в лунку 24-луночного планшета и инкубируйте при комнатной температуре не менее 1 ч. Перед использованием удалите раствор для покрытия. Покрытые планшеты можно хранить при комнатной температуре в течение 3 дней. Перенесите всю среду, содержащую клетки и вирус, в покрытую лунку. Соберите оставшиеся клетки, добавив еще 0,5 мл свежей среды для клеток крови, и перенесите их в лунку с клетками. Центрифугируйте планшет при 1 150 x g в течение 10 мин при 35 °C. После центрифугирования удалите супернатант, добавьте 1 мл среды для иПСК и поддерживайте клетки при 37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение ночи. Второй перенос клеток (день 2) Покройте лунки нового 24-луночного планшета витронектином в концентрации 5 мкг/мл, как описано в пункте 1.2.1. Используйте одну лунку планшета для каждой трансдукции. Перенесите клеточную суспензию из первого планшета на новый планшет, покрытый витронектином. ПРИМЕЧАНИЕ: Если в этом нет необходимости, клетки из суспензии можно удалить. Процедуру, описанную в пункте 2.3, можно повторить 2-3 раза с клетками из суспензии. В случае повторения данных этапов соберите клетки. Тем временем добавьте 1 мл среды для иПСК (индуцированных плюрипотентных стволовых клеток) в лунку первого планшета для поддержания жизнеспособности и инкубируйте при 37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение ночи. Поддерживайте прикрепленные клетки при 37 °C и 5% CO₂, ежедневно заменяя среду на свежую среду для иПСК. Колонии появятся на 14–21 день после трансдукции. Центрифугируйте новый покрытый планшет, содержащий клетки в суспензии, при 1 150 x g и 35 °C в течение 10 мин. После центрифугирования инкубируйте клетки при 37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение ночи. На следующий день удалите супернатант и замените его свежей средой для иПСК. ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуру, описанную в пункте 1.3, можно повторить 2-3 раза с клетками из суспензии. При повторении данных этапов соберите клетки из супернатанта и повторите пункт 1.3. Поддерживайте прикрепленные клетки, ежедневно меняя среду, до достижения 80% конфлюэнтности. Рим, Y. A., и др. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из клеток крови с использованием вируса Сендай и центрифугирования. J. Vis. Exp. (2016).
В данном видео демонстрируется получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) из мононуклеарных клеток периферической крови человека с помощью репрограммирования, опосредованного вирусом Сендай. Вирусные факторы транскрипции активируют сети плюрипотентности и подавляют гены клеточной дифференцировки, что позволяет части клеток приобрести адгезивные свойства и сформировать колонии иПСК. Протокол обеспечивает обогащение и поддержание этих репрограммированных клеток путем селективного связывания с матриксом и ежедневной замены среды.
