Анализ интернализации вируса гриппа с помощью метода блокировки стрептавидином

Аннотация

Источник: Поль, М. О. & Stertz, S. Измерение прикрепления и интернализации вируса гриппа А в клетках A549 методом проточной цитометрии. J. Vis. Exp. (2015)

В данном видео демонстрируется использование анализа с блокировкой стрептавидином для разграничения вируса гриппа, связанного с поверхностью, и интернализованного вируса в эпителиальных клетках легких человека. Сравнение сигналов флуоресценции показывает, что более высокая интенсивность после инкубации указывает на успешную интернализацию вируса.

Протокол

1. Анализ прикрепления и интернализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом анализа убедитесь, что все реагенты подготовлены. Для трех контрольных групп, представленных в разделе результатов (ложноинфицированные клетки, клетки, предварительно обработанные нейраминидазой, и клетки, обработанные азидом натрия), требуются небольшие изменения в протоколе.

1. Подготовьте 16 глубоких пробирок, в каждой из которых должно быть 200,000 клеток A549. Помимо экспериментальной группы из 4 пробирок, предусмотрены 3 контрольных условия, каждое из которых требует 4 пробирок: ложноинфицированные клетки, клетки, предварительно обработанные нейраминидазой (NA), и клетки, обработанные азидом натрия. Каждая группа состоит из 4 пробирок с маркировкой «0 мин», «0 мин + стрептавидин (STV)», «30 мин», «30 мин + STV».
2. Центрифугируйте пробирки при 4 °C в течение 3 мин при 450 x g. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 200 µl фосфатно-солевого буфера (PBS).
3. Центрифугируйте пробирки при 4 °C при 450 x g. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 200 µl модифицированной среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 0.3% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 20 mM 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES) и 1% пенициллина-стрептомицина (инкубационная среда). Инкубируйте в течение 30 мин при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля нейраминидазой: используйте бактериальную нейраминидазу (например, сиалидазу из Vibrio cholera) в концентрации 200 mU/ml, разведенную в инкубационной среде, для ресуспендирования клеток.
4. Центрифугируйте пробирки при 4 °C в течение 3 мин при 450 x g. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 200 µl PBS. Повторите этот шаг еще один раз, затем охладите пробирки на льду в течение 10 мин.
5. Центрифугируйте пробирки при 4 °C в течение 3 мин при 450 x g. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 100 µl биотинилированного вируса (используйте концентрацию вируса, определенную в разделе 2, разведенную в PBS для инфицирования). Инкубируйте 1 ч на льду.
6. Центрифугируйте пробирки при 4 °C в течение 3 мин при 450 x g. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 200 µl PBS. Повторите этот шаг еще один раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для ложноинфицированного контроля: используйте PBS для инфицирования без вируса. Для контроля азидом натрия: используйте вирус, разведенный в PBS для инфицирования с добавлением 0.1 % азида натрия.
7. Обработка образцов после инфицирования на льду:
   1. Для образцов «0 мин» выполните шаг 2.5 и храните образцы при 4 °C до момента фиксации остальных образцов.
   2. Для образцов «0 мин + STV» центрифугируйте пробирки при 4 °C в течение 3 мин при 450 x g. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадки в 50 µl STV (используйте концентрацию, определенную в разделе 3), разведенного в PBS, содержащем 2% BSA и 0.1% азида натрия (для предотвращения интернализации при работе с образцом). Инкубируйте 30 мин на льду.
   3. Центрифугируйте пробирки при 4 °C в течение 3 мин при 450 x g. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 200 µl PBS. Повторите этот шаг еще один раз.
   4. Для фиксации центрифугируйте пробирки при 4 °C в течение 3 мин при 450 x g. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 100 µl 3.7% параформальдегида (PFA). Инкубируйте в течение 10 мин при RT. Затем повторите стадию промывки, описанную в пункте 1.6), и храните образцы при 4 °C.
   5. Для образцов «30 мин» центрифугируйте пробирки при 4 °C в течение 3 мин при 450 x g. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 200 µl PBS, содержащего 2% BSA. Инкубируйте 30 мин при 37 °C. Выполните шаги 1.7.3–1.7.4 и храните образцы при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля азидом натрия: для 30-минутной инкубации при 37 °C используйте PBS с добавлением 2 % BSA и 0.1 % азида натрия.
   6. Для образцов «30 мин + STV» центрифугируйте пробирки при 4 °C в течение 3 мин при 450 x g. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 200 µl PBS, содержащего 2% BSA. Инкубируйте 30 мин при 37 °C. Затем центрифугируйте пробирки при 4 °C в течение 3 мин при 450 x g. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадки в 50 µl STV (используйте концентрацию, определенную в разделе 3), разведенного в PBS, содержащем 2% BSA и 0.1% азида натрия (для предотвращения интернализации при работе с образцом). Инкубируйте 30 мин на льду. Выполните шаги 1.7.3–1.7.4 и храните образцы при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля азидом натрия: для 30-минутной инкубации при 37 °C используйте PBS с добавлением 2 % BSA и 0.1 % азида натрия.
8. Для пермеабилизации центрифугируйте пробирки при 4 °C в течение 3 мин при 450 x g. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 100 µl PBS, содержащего 0.5% Triton X-100. Инкубируйте в течение 6 мин при RT. Затем повторите стадию промывки, описанную в пункте 1.6).
9. Центрифугируйте пробирки при 4 °C в течение 3 мин при 450 x g. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 50 µl 2% BSA, разведенного в PBS, содержащем STV-Cy3. (Обратите внимание, что подходящая концентрация STV-Cy3 должна быть определена до начала эксперимента. Начните с концентрации 1:200 и протестируйте двукратные разведения до 1:2,400. В нашей практике оптимальным оказалось разведение 1:1,000).
10. Инкубируйте 1 ч в темноте при RT. Затем повторите стадию промывки, описанную в пункте 1.6, но ресуспендируйте осадок в 200 µl 2% BSA, разведенного в PBS.
11. Проанализируйте образцы методом проточной цитометрии. Определите процент Cy3-положительных клеток в каждом образце.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM	Life Technologies	41966-052
FBS	Life Technologies	10270-106
Пенициллин-стрептомицин	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-сахароза	Fluka	84100
Bio Rad Protein Bio Assay	Bio Rad	500-0006
Глубокие пробирки (микропробирки 1.2 ml)	Milian	82 00 001
PFA	Lucerna chem Electron microscopy sciences	15710
Пробирки для ультрацентрифугирования	Hemotec HmbH	253070
Triton X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
Азид натрия	Fluka	71290
Бактериальная нейраминидаза/сиалидаза	Sigma-Aldrich	N6514-1UN