Оценка подавления бактериального роста с помощью бактериофагов с использованием измерений оптической плотности

Аннотация

Источник: Niu, Y. D., и др. Эффективность бактериофагов для биоконтроля пищевых патогенов, оцененная с помощью высокопроизводительных методов. J. Vis. Exp. (2021)

В данном видео демонстрируется метод анализа с использованием микропланшетов для оценки литической активности коктейлей из фагов против E. coli бактериальных культур. В видео показано, как изменения оптической плотности позволяют определить активность фагов и концентрацию, необходимую для полного подавления роста бактерий

Протокол

1. Приготовление буфера и реагентов

1. Приготовьте 50 mL tryptic soy broth (TSB) (15 g порошка TSB и 50 mL ультрачистой воды) и автоклавируйте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данный раствор может храниться при комнатной температуре до 3 месяцев или при 4 °C до 6 месяцев.
2. Приготовьте 50 mL tryptic soy agar (TSA) (20 g порошка TSA и 500 mL ультрачистой воды) и автоклавируйте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данный агар может храниться при 4 °C до 3 месяцев.
3. Приготовьте 50 mL фосфатно-солевого буфера (PBS; 4 g NaCl, 0.1 g KCl, 0.7 g Na₂HPO₄ и 0.12 g KH₂PO₄, 50 mL ультрачистой воды), измерьте и доведите pH до 7.2 ± 0.2 при 25 °C, затем автоклавируйте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данный раствор может храниться при 4 °C до 6 месяцев.
4. Приготовьте 20 mL 1 M MgSO₄ (49.294 g и 20 mL ультрачистой воды) и стерилизуйте через полиэфирсульфонный фильтр 0.2 µm.
5. Приготовьте 50 mL TSB с 10 mM MgSO₄ (mTSB; 15 g порошка TSB, 50 mL ультрачистой воды и 5 mL 1 M MgSO₄) и автоклавируйте; дайте автоклавированной среде остыть до комнатной температуры. Соблюдайте правила асептики. С помощью серологической пипетки осторожно перенесите 5.0 mL 1 M MgSO₄; аккуратно перемешайте круговыми движениями.

2. Подготовка бактериальной культуры

1. Для подготовки культуры бактериальной исследовательской лаборатории (BRLC) извлеките флакон(ы) со стоком в глицерине из морозильной камеры и перенесите их в лабораторию.
2. Используя одноразовую инокуляционную петлю или аналог, окуните её во флакон, возьмите порцию инокулята (замерзшей кашицы) и проведите посев штрихом на чашку с TSA или аналогичной средой в шкафу биологической безопасности II класса. Инкубируйте чашку при 37 ± 2 °C в течение 15−18 ч.
3. Поместите подготовленные чашки BRLC в пакет и храните при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общий срок годности BRLC: 14 дней при 4 °C после приготовления.
4. Инокулируйте одну колонию каждого штамма E. coli O157 из чашек BRLC, предназначенных для тестирования, в 10 mL TSB и инкубируйте статически при 37 °C в течение 18 ч до достижения концентрации 9 log10 CFU/mL.
5. Приготовьте серию разведений ночных культур (на следующее утро) для каждого штамма E. coli O157, используя mTSB, содержащую 10 mM MgSO₄, чтобы достичь 4-5 log10 CFU/ml (или другого требуемого уровня инокулята).
6. Смешайте равные объемы ночных культур каждого штамма для достижения общей концентрации 4-5 log10 CFU/mL (или по необходимости), чтобы приготовить бактериальную смесь.
7. Немедленно поместите разведенную бактериальную культуру при 4 °C до использования.
8. Разведите культуру инокулята в 10 или 10 раз и высейте аликвоты по 0.1 mL этих разведений на чашки с TSA для получения изолированных колоний.

3. Приготовление рабочих растворов фагов

1. Размножьте рабочие стоки каждого фага с высоким титром (≥108 PFU/mL), которые будут подвергнуты скринингу, следуя стандартным методам4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общий срок годности стоков фагов составляет 3 месяца при хранении в пластиковом флаконе при 4 °C после получения.
2. Для достижения желаемого титра, например ~10⁸ PFU/mL для кинетики лизиса, разведите отдельные препараты фагов в mTSB, содержащем 10 mM MgSO₄. Приготовьте коктейли фагов, смешивая равные объемы каждого рабочего стока с одинаковым титром во всех возможных комбинациях.

4. Подготовка in-vitro кинетики лизиса для отдельных фагов и коктейлей фагов

1. Для проведения анализа в микропланшете подготовьте серийные десятикратные разведения каждого фага в колонках 1–8 в стерильных 96-луночных микропланшетах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На каждом планшете в соседних колонках можно в дубликатах протестировать четыре фага против одного бактериального штамма. Остальные четыре колонки используются для контролей без фага, а также для холостой пробы mTSB (Рисунок 1).
2. Внесите по 180 µL mTSB в лунки с 1 по 12 колонку 96-луночного микропланшета.
3. Добавьте по 20 µL разведенных отдельных фагов или коктейлей фагов (~108 PFU/mL) в лунки 1–8 верхнего ряда микропланшета (ряд A).
4. Для контроля без фага и холостой пробы добавьте по 20 µL mTSB в верхние лунки колонок 9, 10 и 1.
5. С помощью 12-канального дозатора выполните разведение по планшету. Переносите по 20 µL из ряда в ряд. Тщательно перемешивайте содержимое путем осторожного многократного аспирирования и извлечения жидкости (не менее пяти раз), меняя наконечники между разведениями. Удалите 20 µL из последнего ряда (ряд H).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать наконечники с фильтрами для предотвращения перекрестного загрязнения.
6. Подготовьте резервуар для каждого штамма. С помощью дозатора на 1 mL перенесите 2–3 mL разведенной культуры в резервуар. Для колонок 1–10 с помощью многоканального дозатора добавьте по 20 µL разведенной бактериальной культуры в каждую лунку. Меняйте наконечники после каждого внесения.
7. Закройте микропланшет и инкубируйте его при заданных условиях (например, 37 °C в течение 10 h или 2 °C в течение 2 h).
8. Через 2 h или через другие заданные интервалы времени извлеките микропланшеты из инкубатора.

Результаты

Рисунок 1: Рекомендуемая схема анализа в 96-луночном микропланшете. Серийные десятикратные разведения каждого фага готовят в столбцах 1–8 стерильных 96-луночных микропланшетов. Четыре фага против одного бактериального штамма можно протестировать в дубликатах в соседних столбцах на каждом планшете. Остальные столбцы используются для контролей.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Основные материалы, реагенты и оборудование
Гептагидрат сульфата магния	Sigma	1374361
Дозатор Pipet-Lite LTS L-10XLS+	METTLER TOLEDO	17014382
Пипетка Pipet-Lite LTS L-30XLS+	METTLER TOLEDO	17014405
Многоканальный дозатор Pipet-Lite L12-20XLS+	METTLER TOLEDO	17013808
Дозатор Pipet-Lite, Unv. SL-20XLS+	METTLER TOLEDO	17014412
Наконечники для дозаторов RT LTS 1000µL FL 768A/8 с низкой сорбцией	METTLER TOLEDO	30389213
Наконечники для дозаторов SR LTS 20µL F 960A/5	METTLER TOLEDO	17005860
Резервуар	METTLER TOLEDO	89094-662
Стерильные прозрачные полистирольные 96-луночные микропланшеты с плоским дном и крышками	Fisher	168055
Триптикасовый соевый агар (TSA)	Sigma	105458-0500
Трипсо-соевый бульон (TSB)	Sigma	105459-0500
Т-образные клеточные шпатели	VWR	76299-566
Оборудование
Компактные микробиологические инкубаторы	Fisher	5012590H
Многогранные магнитные мешалки	Fisher	14-512-125	длина: 20 мм
Гибридный многофункциональный ридер Synergy Neo2	Fisher	BTNEO2M
Программное обеспечение
SAS	SAS Institute	9.4