Маркирование реплицирующихся геномов HSV-1 с помощью нуклеозидного аналога

Аннотация

1. Культивирование клеток, вирусное заражение и маркировка EdC (5-этинил-2′-дезоксицитидином) (Рисунок 1) Следующий протокол предполагает работу с вирусами. Пожалуйста, ознакомьтесь с протоколами биобезопасности вашего учреждения, касающимися безопасного обращения с вирусами и другими биологическими агентами. Данный протокол был одобрен Институциональным наблюдательным советом Университета Питтсбурга. Проведите трипсинизацию конфлюэнтного флакона для культивирования тканей объемом 150 см² с клетками MRC-5 (линия клеток Medical Research Council 5) и перенесите клетки в планшет для культивирования тканей объемом 600 см², содержащий 100 мл DMEM (модифицированной среды Игла в модификации Дульбекко) с добавлением 10% FBS (эмбриональной телячьей сыворотки). Инкубируйте при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение 3–4 дней до достижения конфлюэнтности и стационарной фазы. Конфлюэнтное блюдо объемом 600 см² содержит ~7 x 10⁷ клеток. Подготовьте по одному планшету для каждого условия и по одному планшету для каждого соответствующего отрицательного контроля. ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны достичь стационарной фазы, чтобы ингибировать репликацию клеточной ДНК и гарантировать, что на последующих этапах будет маркирована и очищена только вДНК (вирусная ДНК). ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца требуется соответствующий немаркированный отрицательный контроль, подготовленный в тех же условиях заражения и в той же временной точке, но без добавления EdC. ПРИМЕЧАНИЕ: Параллельно следует провести сокращенную версию этого эксперимента для проверки маркировки клеточной ДНК с помощью визуализации, используя сопоставимые условия роста клеток, заражения, маркировки EdC и временные точки (см. Шаг 2). Разведите 7 x 10⁸ PFU (бляшкообразующих единиц) HSV-1 в 7 мл холодного трис-солевого буфера (TBS). Удалите ростовую среду и храните при 37 °C. Для заражения добавьте 7 мл разведенного вируса к клеткам MRC-5 и перемешивайте путем раскачивания в течение 1 ч при комнатной температуре. После адсорбции удалите инокулят, промойте 50 мл TBS комнатной температуры и верните исходную ростовую среду. Инкубируйте при 37 °C в атмосфере 5% CO2. Этот шаг следует выполнить для каждого экспериментального условия и отрицательного контроля. ПРИМЕЧАНИЕ: Повышенную эффективность маркировки EdC можно достичь, используя мутанты HSV-1 с дефектом экспрессии вирусной dUTPase (ген UL50) и/или урацил-гликозилазы (ген UL2). dUTPase HSV-1 обладает низкой субстратной специфичностью и может снижать активацию нескольких нуклеозидных аналогов. Проведите маркировку вирусных геномов EdC. Следуйте инструкциям по маркировке входящих геномов (1.3.1.), реплицирующихся геномов (1.3.2.) или вирусных репликационных вилок (1.3.3.). ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от того, какие объекты будут анализироваться на последующих этапах — входящие геномы, реплицированные геномы или репликационные вилки соответственно, — следует выполнять только Шаг 1.3.1, 1.3.2 или 1.3.3. ПРИМЕЧАНИЕ: EdC можно заменить на EdU или f-ara EdU. Необходимо контролировать и минимизировать токсичность нуклеозидных аналогов. Используйте предварительно маркированные стоки для проведения заражения на Шаге 1.2 и переходите к Шагу 2 или 3 в течение 4 ч после заражения (hpi), чтобы исследовать нереплицированную вДНК (Рисунок 1A). ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте предварительно маркированные стоки вируса, используя ранее описанный протокол25. Стоки вируса должны быть пропущены через колонку G-25 для удаления остатков EdC. Проведите маркировку реплицирующейся вДНК, добавив 5–25 мкМ EdC в среду для культивирования зараженных клеток на 2–4 ч (Рисунок 1B). Перед добавлением разведите EdC в 1 мл ростовой среды. Для маркировки вирусных репликационных вилок после начала репликации вДНК (≥4 ч после заражения) проведите импульсную маркировку реплицирующейся вДНК 5–25 мкМ EdC в течение 5–20 мин. Для проведения «погони» (chase) промойте 3 раза средой для погони, содержащей 25–100 мкМ 2′-дезоксицитидина (дезоксиC), а затем инкубируйте в среде для погони еще 20–40 мин (Рисунок 1C). ПРИМЕЧАНИЕ: Среды для импульса и погони перед использованием следует уравновесить при 37 °C и 5% CO2. ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении экспериментов с импульсной маркировкой и погоней важно учитывать время, необходимое для проникновения нуклеозидов в клетку и их фосфорилирования перед встраиванием в реплицирующуюся ДНК. Это значение необходимо определить эмпирически. ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить разрешение экспериментов с импульсной маркировкой и погоней, рассчитайте скорость вирусной репликации в используемых экспериментальных условиях. Это можно сделать с помощью количественной ПЦР вирусных геномов в ходе одноступенчатого анализа кривой роста. Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Очистка вирусной ДНК для идентификации ассоциированных вирусных и клеточных белков. J. Vis. Exp. (2017)

В данном видео демонстрируется заражение клеток млекопитающих в стационарной фазе вирусом HSV-1 (вирус простого герпеса 1-го типа) с последующей репликацией вирусного генома с использованием репликативного аппарата хозяина и вируса. Синтетический аналог нуклеозида встраивается в синтезируемую вирусную ДНК для маркировки реплицирующихся геномов, которые затем выделяют для протеомного анализа связанных с ними белков хозяина и вируса.

Протокол

1. Культивирование клеток, вирусное заражение и маркировка EdC (5-этинил-2′-дезоксицитидином) (Рисунок 1)

Следующий протокол предполагает работу с вирусами. Пожалуйста, ознакомьтесь с протоколами биологической безопасности вашего учреждения, касающимися безопасного обращения с вирусами и другими биологическими агентами. Данный протокол был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) Питтсбургского университета.

1. Проведите трипсинизацию клеток MRC-5 (линия клеток Медицинского исследовательского совета 5) в конфлюэнтном флаконе для культивирования тканей объемом 150 cm² и перенесите клетки в планшет для культивирования тканей объемом 600 cm2, содержащий 100 mL DMEM (модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко) с добавлением 10% FBS. Инкубируйте при 37 °C в присутствии 5% CO₂ в течение 3 - 4 дней до достижения конфлюэнтности и стационарной фазы. Конфлюэнтное блюдо объемом 600 cm2 содержит ~7 x 10⁷ клеток. Подготовьте по одному планшету для каждого условия и по одному планшету для каждого соответствующего отрицательного контроля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны достичь стационарной фазы, чтобы подавить репликацию клеточной ДНК и гарантировать, что на последующих этапах будет мечена и очищена только vDNA (вирусная ДНК).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца требуется соответствующий немеченый отрицательный контроль, подготовленный при тех же условиях инфекции и в той же временной точке, но без добавления EdC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параллельно следует провести уменьшенную версию этого эксперимента для проверки мечения клеточной ДНК с помощью визуализации, используя сопоставимые условия роста клеток, инфекции, мечения EdC и временные точки (см. Шаг 2).
2. Разведите 7 x 10⁸ PFU (бляшкообразующих единиц) HSV-1 в 7 mL холодного Трис-буферного физраствора (TBS). Удалите ростовую среду и выдержите при 37 °C. Для инфицирования добавьте 7 mL разведенного вируса к клеткам MRC-5 и перемешивайте на качалке в течение 1 ч при комнатной температуре. После адсорбции удалите инокулят, промойте 50 mL TBS комнатной температуры и замените исходную ростовую среду. Инкубируйте при 37 °C в присутствии 5% CO₂. Этот шаг следует выполнить для каждого экспериментального условия и отрицательного контроля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повышение эффективности мечения EdC может быть достигнуто при использовании мутантов HSV-1 с дефектом экспрессии вирусной dUTPase (ген UL50) и/или урацил-гликозилазы (ген UL2). dUTPase HSV-1 обладает низкой субстратной специфичностью и может снижать активацию нескольких нуклеозидных аналогов.
3. Проведите мечение вирусных геномов EdC. Следуйте инструкциям по мечению входящих геномов (1.3.1.), реплицирующихся геномов (1.3.2.) или вирусных репликационных вилок (1.3.3.).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от того, какие объекты будут анализироваться на последующих этапах (входящие геномы, реплицированные геномы или репликационные вилки соответственно), следует выполнять только шаг 1.3.1, 1.3.2 или 1.3.3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо EdC можно использовать EdU или f-ara EdU. Необходимо контролировать и минимизировать токсичность нуклеозидных аналогов.
   1. Используйте предварительно помеченные стоки для проведения инфекции на Шаге 1.2 и переходите к Шагу 2 или 3 в течение 4 ч после инфицирования (hpi) для исследования нереплицированной vDNA (Рисунок 1A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте предварительно помеченные вирусные стоки, используя ранее описанный протокол 25. Вирусные стоки должны быть пропущены через колонку G-25 для удаления остаточного EdC.
   2. Проведите мечение реплицирующейся vDNA, добавив 5 - 25 µM EdC в среду для культивирования инфицированных клеток на 2 - 4 ч (Рисунок 1B). Перед добавлением разведите EdC в 1 mL ростовой среды.
   3. Для мечения вирусных репликационных вилок после начала репликации vDNA (≥4 hpi) проведите импульсное мечение реплицирующейся vDNA 5 - 25 µM EdC в течение 5-20 мин. Для проведения «погони» (chase) промойте 3 раза средой для погони, содержащей 25 - 100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC), а затем инкубируйте в присутствии среды для погони еще в течение 20-40 мин (Рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среду для импульса и погони следует довести до температуры 37 °C и 5% CO₂ перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении экспериментов с импульсным мечением и погоней важно учитывать время, необходимое для проникновения нуклеозидов в клетку и их фосфорилирования перед включением в реплицирующуюся ДНК. Это значение необходимо определить эмпирически.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения разрешения экспериментов с импульсным мечением и погоней рассчитайте скорость вирусной репликации в используемых экспериментальных условиях. Это можно сделать с помощью количественной ПЦР вирусных геномов в ходе одноступенчатого анализа кривой роста.

Результаты

Рисунок 1: Подходы к мечению ДНК HSV-1. (A) Для анализа состояния входящего вируса покоящиеся клетки MRC-5 в фазе G0 инфицируют предварительно помеченным HSV-1, после чего через менее чем 4 ч после инфицирования (hpi) анализируют геномы для изучения нереплицированной вирусной ДНК. (B) Для анализа состояния реплицированного вируса клетки MRC-5 инфицируют непомеченным HSV-1, после чего в ростовую среду инфицированных клеток добавляют EdC (оранжевые звезды) и инкубируют в течение 2–4 ч после начала репликации вирусной ДНК (≥4 hpi). (C) Для анализа вирусных репликационных вилок инфицированные клетки подвергают импульсному мечению EdC в течение 5–20 мин. Затем репликационные вилки можно «прогнать» с помощью deoxyC. ДНК, помеченная EdC, обозначена оранжевым цветом. Данный рисунок модифицирован из работы Dembowski и DeLuca

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клетки MRC-5	ATCC	CCL-171
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Gibco	26140-179
Среда DMEM (модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко)	Gibco	12800-082	Дополнена 10% FBS, 2 mM L-глутамином, 12 mM (для культивирования в колбах) или 30 mM (для культивирования в чашках) бикарбоната натрия
Чашка для культивирования тканей 600 cm²	Thermo Fisher Scientific	166508
Трис-буферный физиологический раствор (TBS), pH 7.4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
Сток HSV-1			Лучше всего подходят стоки с титром более 1x109 PFU/mL
5´-Этинил-2´-дезоксицитидин (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	Растворить в DMSO для приготовления 40 mM стока, разделить на аликвоты и хранить при -20 °C
Инкубатор для культур клеток
Бокс биологической безопасности
Термоблоки			65 °C и 95 °C