Выделение белков из вирусных ДНК-белковых комплексов

Аннотация

Источник: Дембовски, Дж. А., и др.Очистка вирусной ДНК для идентификации ассоциированных вирусных и клеточных белков. J. Vis. Exp.. (2017).

В данном видео демонстрируется выделение комплексов белок–вирусная ДНК из ядер клеток с использованием клик-химии и очистки на магнитных частицах. Протокол включает мечение вирусных геномов нуклеотидами, модифицированными алкином, биотинилирование посредством клик-реакции и связывание с магнитными частицами, покрытыми стрептавидином. После промывки и тепловой элюции очищенные комплексы собирают, подвергают мгновенному замораживанию и хранят для последующего анализа.

Протокол

1. Очистка вДНК и ассоциированных белков

ПРИМЕЧАНИЕ: все буферы и реагенты перед использованием следует охладить на льду; все этапы процедуры должны выполняться на льду, если не указано иное.

1. Сбор ядер. ПРИМЕЧАНИЕПеред выделением ядер можно использовать формальдегид для сшивания белков с ДНК. В этом случае при очистке ДНК на магнитных частицах, покрытых стрептавидином, можно применять более жесткие условия промывки.
   1. Замените питательную среду 20 мл буфера для экстракции ядер (NEB) и инкубируйте в течение 20 мин при 4 °C при периодическом покачивании. Ядра станут видны под микроскопом.
   2. Соберите ядра с планшета с помощью скребка для клеток и перенесите их в коническую пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте в течение 10 мин при 2500 x g при 4 °C для осаждения ядер удалите супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕОкрашивание трипановым синим может быть использовано для подтверждения выделения ядер из клеток.
   3. Осторожно ресуспендируйте осадок ядер в 10 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS), перенесите его в коническую пробирку объемом 15 мл и осадите путем центрифугирования в течение 10 мин при 2500 x g при 4 °CПолностью удалите PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ядра можно заморозить, и на этом этапе выполнение протокола можно приостановить. Для этого осторожно ресуспендируйте осадок ядер в 500 µL буфер для замораживания и инкубируйте пробирку в смеси этанола с сухим льдом. Храните замороженные ядра при температуре -80 °CПеред использованием разморозьте ядра при комнатной температуре, быстро перенесите их на лед, добавьте 10 мл PBS, осторожно перемешайте на качалке и осадите центрифугированием в течение 10 мин при 2 500 x g при 4 °Cи полностью удалите PBS. Замораживание ядер может привести к снижению выхода.
2. Ковалентно конъюгируйте биотин-азид с 5-этинил-2-′вирусная ДНК, меченная 5-дезоксицитидином (EdC), или вДНК.
   1. Ресуспендируйте осадок ядер в 10 мл смеси для клик-реакции [см. Перечень материалов], осторожно перемешивая содержимое путем пятикратного пипетирования вверх-вниз с помощью дозатора на 10 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕВажно добавлять реагенты в смесь для клик-реакции строго в указанном порядке.
   2. Перемешивайте в ротаторе в течение 1 ч при 4 °CПри перемешивании приготовьте и охладите буферы B1, B2 и B3 [см. Список материалов].
   3. Осадите ядра центрифугированием в течение 10 мин при 2500 x g при 4 °CПолностью удалите смесь для клик-реакции и промойте осадок, осторожно ресуспендировав его в 10 мл PBS и центрифугируя в течение 10 мин при 2500 x g при 4 °C.
   4. Осторожно ресуспендируйте осадок ядер в 1 мл PBS и перенесите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, используя наконечник для пипетки с широким отверстием. Осадите ядра путем центрифугирования в течение 10 мин при 2500 x g при 4 °CПолностью удалите PBS и подвергните быстрому замораживанию в жидком азоте.
      ПРИМЕЧАНИЕНа этом этапе выполнение протокола можно приостановить; замороженные ядра можно хранить при температуре -80 °CЗамораживание с последующим оттаиванием способствует более эффективному лизису, поэтому рекомендуется подвергать ядра мгновенной заморозке, даже если переход к этапу 1.3 запланирован на тот же день.
3. Проведите лизис ядер и фрагментацию ДНК.
   1. Разморозьте ядра на льду и ресуспендируйте в 500 µL Добавьте буфер B1, перемешивая содержимое путем пипетирования. Инкубируйте на льду в течение 45 минут.
   2. Обработайте образцы ультразвуком 6 раз по 30 с с амплитудой 40%, используя микрозонд диаметром 3 мм. Между импульсами выдерживайте образцы на льду по 30 с. После соникации образцы должны стать прозрачными, без помутнения.
      ПРИМЕЧАНИЕУсловия соникации следует оптимизировать для каждого конкретного соникатора.
   3. Осадите клеточный дебрис путем центрифугирования при 14 000 x g в течение 10 мин при 4 °CРазмер осадка должен существенно уменьшиться. Профильтруйте супернатант через 100 µM пропустите через клеточный фильтр и соберите фильтрат.
   4. Добавьте 500 µL добавьте буфер B2 к отфильтрованному супернатанту. 900 µL эта часть образца будет использована на этапе 1.4.2.
   5. Возьмите аликвоту для выделения ДНК для каждого условия (50 µL или 1/20 объема) и добавьте 50 µL 2-кратный раствор додецилсульфата натрия (SDS) и бикарбоната [см. Список материалов]. Переходите к протоколу выделения ДНК.
   6. Возьмите аликвоту для каждого условия в качестве контрольного образца белка (input) (50 µL или 1/20 от объема) и добавить 50 µL 2x буфер Лаеммли для подготовки проб, заморозить в жидком азоте и хранить при -80 °C.
4. Свяжите биотинилированную ДНК с магнитными бусинами, покрытыми стрептавидином.
   1. Подготовьте магнитные бусины Streptavidin T1, перенеся 300 µL суспензии бусин в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Подготовьте по одной пробирке с бусинами на каждый образец. Промойте бусины 3 раза 1 мл буфера B2, используя вортекс для ресуспендирования, магнит для осаждения бусин и аспирацию для удаления промывочного буфера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация условий связывания позволяет максимально увеличить выход продукта и минимизировать неспецифическое связывание. Экспериментально было установлено, что магнитные бусины Streptavidin T1 обладают значительно более высокой связывающей способностью, чем агарозные или другие стрептавидиновые бусины, а также обеспечивают меньший уровень фонового связывания по сравнению с бусинами Streptavidin C1 (Рисунок 1A).
   2. Добавьте 900 µL образца из этапа 1.3.4 к промытым магнитным частицам и перемешивать в ротаторе в течение ночи при 4 °C.
      Примечание: После добавления образца к гранулам не подвергайте их вортексированию.
      ПРИМЕЧАНИЕЕсли в немаркированном отрицательном контроле выделяются значительные количества ДНК или белка, время данного этапа можно сократить с ночного инкубирования до 4 ч для снижения уровня неспецифического связывания.
5. Промойте магнитные частицы и элюируйте вирусную ДНК и ассоциированные с ней белки.
   ПРИМЕЧАНИЕДля всех последующих этапов рекомендуется использовать наконечники с фильтром.
   1. Поместите образцы в штатив для магнитных микроцентрифужных пробирок, удалите супернатант, осторожно ресуспендируйте в 1 мл буфера B2 и перемешайте на ротаторе при 4 °C в течение 5 мин.
   2. Повторите шаг 1.5.1 трижды.
   3. Поместите образцы в штатив для магнитных микроцентрифужных пробирок, удалите супернатант, аккуратно ресуспендируйте в 1 мл буфера B3 и перемешивайте на ротаторе при 4 °C в течение 5 мин.
   4. Перенос 100 µL смесь бусин (1/10 объема) в новую пробирку для выделения связанной ДНК. Поместите пробирку в магнит, удалите супернатант, ресуспендируйте бусины в 100 µL 1x раствор додецилсульфата натрия или SDS-бикарбонатный раствор, после чего перейдите к протоколу выделения ДНК.
   5. Примените пробирку, содержащую оставшуюся 900 µL смесь гранул из этапа 1.5.3 к магниту, удалите супернатант и ресуспендируйте гранулы в 50 µL 2x буфер для подготовки проб по Лэммли для элюции белков и белково-ДНК-комплексов.
   6. Прокипятить образцы при 95 °C в течение 15 мин, перемешать на вортексе, быстро центрифугировать в микроцентрифуге и поместить на магнит. Перенести элюат в новую пробирку, подвергнуть мгновенному замораживанию и хранить при температуре -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕИспользуйте фиксирующие крышки, чтобы пробирки не открылись во время кипячения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе выполнение протокола можно приостановить, а образцы хранить при температуре -80 °C в течение нескольких недель.
   7. Проанализируйте образцы белков с помощью окрашивания кумасси синим, вестерн-блоттинга или масс-спектрометрии в соответствии со стандартными процедурами. Репрезентативные результаты представлены на Рисунки 1 и 2.
      ПРИМЕЧАНИЕЧтобы определить, достаточно ли выхода белка для масс-спектрометрии, 7.5 µL каждого образца используется для анализа методом окрашивания кумасси синим и 7.5 µL для вестерн-блоттинга репрезентативного белка, ассоциированного с вирусным геномом (ICP4, ICP8 или UL42). Параллельно наносят тот же объем лизатов из этапа 1.3.6 для контроля уровней исходного белка. Остаток образца (35 µL) затем анализируют методом масс-спектрометрии.

Результаты

Рисунок 1: Репрезентативные результаты очистки белков. (A) Сравнение выхода белка при проведении этапов очистки с использованием нескольких различных типов бусин с покрытием из стрептавидина. Инфицирование проводили в присутствии EdC (+) для сравнения выхода белка или в отсутствие EdC (-) для оценки фонового связывания. Проводили инфицирование и мечение EdC, а затем очищали ДНК-белковые комплексы, используя сопоставимые количества различных типов бусин с покрытием из стрептавидина. Верхняя панель: сравнение выхода белка после очистки на агарозных бусинах с покрытием из стрептавидина или Streptavidin M-280. Нижняя панель: сравнение выхода белка после очистки на Streptavidin M-270, M-280, Streptavidin C1 или Streptavidin T1. Вестерн-блоттинг проводили с использованием антител к вирусного белку ICP4. В первой дорожке для сравнения показан очищенный ICP4. Для наблюдения интенсивности ICP4 в дорожке «280» на нижней панели, аналогичной интенсивности на верхней панели, потребовалась более длительная экспозиция. (B) Показаны репрезентативные результаты очистки белков в зависимости от времени мечения EdC. Проводили инфицирование и мечение EdC, а затем очищали ДНК-белковые комплексы с помощью бусин Streptavidin T1. Мечение EdC проводили в течение 0, 20, 40 или 60 мин; представлены результаты окрашивания кумасси синим (сверху) и вестерн-блоттинга (снизу). Вестерн-блоттинг проводили с антителами, специфичными к ICP4, UL42 или GAPDH. Образец элюата был взят на этапе 1.5.5, а образец лизата — на этапе 1.3.6. Стрелка указывает на стрептавидин, а L — на маркер молекулярной массы белков.

Рисунок 2: Примеры различных способов представления протеомных данных. (A) Круговые диаграммы обобщают данные о белках, идентифицированных методом масс-спектрометрии элюатов белков, ассоциированных с вирусными геномами, очищенными через 6 ч после инфицирования (hpi). Значения указывают количество белков, идентифицированных для каждой функциональной категории. T обозначает общее количество идентифицированных белков. Цвета соответствуют следующим категориям: фиолетовый — процессинг РНК, красный — транскрипция, зеленый — ремоделирование хроматина, оранжевый — репликация ДНК, желтый — ядерный транспорт, бирюзовый — цитоскелет, темно-синий — структурные белки HSV и серый — прочие/неизвестные. (B) Диаграммы Венна иллюстрируют перекрытие белков, которые были идентифицированы как ассоциированные с вирусными геномами через 6, 8 или 12 часов после заражения (hpi). (C) На карте STRING представлены белки, обогащенные в вирусных репликативных вилках после 5-минутного импульса EdC. Белки человека с пятикратным обогащением по сравнению с немаркированным отрицательным контролем отображены на карте функциональных взаимодействий, которая была построена с помощью STRING с настройками данных, позволяющими отображать только взаимодействия с высокой степенью достоверности. Для картирования взаимодействий использовались названия генов. Кругами отмечены белки, участвующие в одном и том же биологическом процессе.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клетки MRC-5	ATCC	CCL-171
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Gibco	26140-179
Модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM)	Gibco	12800-082	Добавить 10% FBS, 2 mM L-глутамина, 12 mM (для выращивания в колбах) или 30 mM (для выращивания в чашках) бикарбоната натрия
Чашка для культивирования тканей 600 cm²	Thermo Fisher Scientific	166508
Трис-солевой буфер (TBS), pH 7.4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
Сток HSV-1			Лучше всего подходят стоки с титром более 1x10⁹ PFU/mL
Колонка Sephadex G-25 (колонка для обессоливания PD-10)	GE Healthcare	17085101
Диметилсульфоксид (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5´-Этинил-2´-дезоксицитидин (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	Растворить в DMSO для приготовления 40 mM стока, разлить по аликвотам и хранить при -20 °C
2´-дезоксицитидин (deoxyC)	Sigma-Aldrich	D3897	Растворить в воде для приготовления 40 mM стока, разлить по аликвотам и хранить при -20 °C
Буфер для экстракции ядер (NEB)			Приготовить свежим (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 300 mM сахарозы, 0.5% Igepal)
Скребок для клеток	Bellco glass	7731-22000	Автоклавировать перед использованием
Раствор трипанового синего	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7.2 (10x)			1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na₂HPO₄, 18 mM KH₂PO₄ (разбавить до 1x в стерильной воде перед использованием)
Пентагидрат сульфата меди (II) (CuSO₄·5H₂O)	Fisher Scientific	C489	Приготовить 100 mM сток и хранить при 4 °C до 1 месяца
(+) L-аскорбат натрия	Sigma-Aldrich	A4034	Приготовить свежий 100 mM сток и хранить на льду до использования
Биотинированный азид	Invitrogen	B10184	Приготовить 10 mM сток в DMSO, разлить по аликвотам и хранить при -20 °C до 1 года
Смесь для клик-реакции			Приготовить непосредственно перед использованием, добавляя реагенты в указанном порядке (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 μL 100 mM CuSO₄, 25 μL 10 mM биотинированного азида, 1 mL 100 mM аскорбата натрия)
Полный коктейль ингибиторов протеаз	Roche	11697498001	Растворить в 1 mL воды для приготовления 50x стока, можно хранить при 4 °C до 1 недели, либо добавить 1 таблетку непосредственно в 50 mL буфера
Буфер для замораживания			Приготовить свежим (7 mL 100% глицерина, 3 mL NEB, 200 μL 50x ингибитора протеаз)
Буфер B1			Приготовить свежим (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x ингибитор протеаз)
Буфер B2			Приготовить свежим (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x ингибитор протеаз)
Буфер B3			Приготовить свежим (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x ингибитор протеаз)
Ультразвуковой процессор Vibra Cell, оснащенный микрозондом 3 mm	Sonics	VCX 130
Клеточный фильтр (стрейнер)	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Life Technologies	65601
Магнит DynaMag-2	Life Technologies	12321D
Ротатор для мини-пробирок	Fisher Scientific	260750F
2x Буфер для образцов по Лэммли			Смешать 400 mg SDS, 2 mL 100% глицерина, 1.25 mL 1 M Tris (pH 6.8) и 10 mg бромфенолового синего в 8 mL воды. Хранить при 4 °C до 6 месяцев. Перед использованием добавить 1 M DTT до конечной концентрации 200 mM.
Фиксаторы крышек для пробирок 1.5 mL	Fisher Scientific	NC9679153
Стандартные реагенты для вестерн-блоттинга
Набор для коллоидного синего окрашивания NOVEX	Invitrogen	LC6025
12-луночная чашка для культивирования тканей	Corning	3513
Покрывные стекла	Fisher Scientific	12-545-100	Автоклавировать перед использованием
Предметные стекла для микроскопа	Fisher Scientific	12-552-5
16% параформальдегид	Electron Microscopy Sciences	15710	Разбавить до 3.7% в 1x PBS перед использованием
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	Приготовить 3% раствор в 1x PBS
Буфер для пермеабилизации (0.5% Triton-X 100)	Sigma-Aldrich	T8787	Приготовить 0.5% Triton-X 100 в 1x PBS
Коктейль для клик-реакции - набор Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Molecular Probes	C10337	Приготовить согласно протоколу производителя
2x SDS-бикарбонатный раствор			2% SDS, 200 mM NaHCO₃
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0			100 mM Tris, 10 mM EDTA (разбавить до 1x перед использованием)
Микроцентрифуга для пробирок 1.5 mL
Настольная центрифуга для пробирок 15 и 50 mL
Инкубатор для культур клеток
Бокс биологической безопасности
Термоблоки			65 °C и 95 °C