Напечатанное на 3D-принтере устройство с силиконовым покрытием для моделирования катетер-ассоциированной инфекции мочевыводящих путей

Аннотация

Источник:
Оушен Э. Кларк¹, Роми А. Доп¹, Том Хаселл¹, Джоан Л. Фотергилл¹, Дэниел Р. Нил<sup>2

1</sup>Ливерпульский университет, ² Университет Данди

В этом видео демонстрируется использование напечатанного на 3D-принтере устройства с силиконовым покрытием, которое имитирует внутреннюю поверхность мочевых катетеров для имитации инфекции мочевыводящих путей, связанной с катетером.

Протокол

Все процедуры по сбору проб были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Аддитивное производство моделей Flexipeg

1. Печатные колышки (требуется 24 штифта на одну колышковую крышку) и колышки в высокотемпературной устойчивой смоле с использованием стереолитографии (высота слоя 100 мкм).
   ЗАМЕТКА: Для колышков используется устойчивая к высоким температурам смола, а крышки для колышков могут быть стерилизованы в автоклаве перед экспериментами.
2. Напечатайте на 3D-принтере как компоненты пресс-формы, так и детали штатива для пробирок с помощью моделирования методом наплавления (FDM) с заполнением 60%.
   ЗАМЕТКА: Для FDM подходит любая прочная смола, так как пресс-формы и штативы для пробирок могут быть стерилизованы этанолом и не требуют стабильности при высоких температурах.
3. Убедитесь, что компоненты модели напечатаны правильно, и удалите все лишние остатки в процессе печати с помощью 70% этанола.
4. Соберите форму для силиконового коврика, как показано на рисунке 1, при необходимости удерживая стороны на месте лентой.

2. Подготовка модели Flexipeg

1. Подготовка силиконового коврика
   1. Взвесьте 18 г силиконовой основы (основание 10:1 к катализатору полидиметилсилоксан (PDMS), отверждение от конденсации) в стакан и аккуратно смешайте с 2 г катализатора до однородной массы.
      ЗАМЕТКА: Избегайте чрезмерного перемешивания силиконовой смеси, чтобы предотвратить образование пузырьков внутри формы.
   2. Вылейте объединенную силиконовую смесь в форму, напечатанную FDM, стерев излишки силиконовой смеси с боковых сторон и верхней части формы. Дайте застыть в течение ночи (минимум 18 часов) при комнатной температуре (RT).
   3. Выньте коврик из формы и обрежьте излишки силикона по бокам. Убедитесь, что коврик входит в колышковую крышку, как показано на рисунке 1.
2. Колышковое покрытие
   1. Вставьте колышки в силиконовый коврик (24 колышка на коврик) и закрепите коврик на крышке колышка или пластиковом лотке аналогичных размеров с ковриком с помощью ленты.
   2. Отвесьте 27 г силиконовой основы в неглубокий пластиковый лоток (примерно такие же размеры, как 96-луночная пластина) и тщательно смешайте 3 г катализатора до однородности.
   3. Переверните крышки колышков так, чтобы колышки были обращены вниз, и сразу же окуните колышки в силиконовую смесь. Переверните крышку колышка и дайте излишкам силикона стечь по колышкам, а колышки затвердеют в течение ночи при комнатной температуре.
      ЗАМЕТКА: Силикон быстрого отверждения (полное отверждение 6-8 часов; время работы 40-60 минут) будет продолжать капать/течь до отверждения; поэтому не обязательно покрывать весь штифт PDMS при погружении, так как любой избыток покроет остальную часть колышка во время отверждения.
   4. После отверждения повторите шаги с 2.2.2 по 2.2.3. до тех пор, пока колышки не будут трижды покрыты PDMS. Убедитесь, что первый слой покрытия полностью отвержден, прежде чем переходить ко второму этапу нанесения покрытия.
      ЗАМЕТКА: Окончательное покрытие колышков должно быть толщиной <2 мм без видимых дефектов. Если силикон остается липким после ночной инкубации в RT, дайте ему застыть в течение 24 часов и выбросьте покрытие, если колышки все еще липкие на ощупь.
   5. С помощью стерильного скальпеля обрежьте вокруг основания колышков с силиконовым покрытием (как можно ближе к низу), чтобы удалить колышки из слоя покрытия.
      ЗАМЕТКА: Этот процесс следует повторять до тех пор, пока не будет подготовлено нужное количество колышков и силиконовых ковриков. Избыток PDMS, используемый в процессе нанесения покрытия на штифты, может быть использован для отливки новых силиконовых матов перед отверждением.
3. Настройка модели
   1. Вставьте колышки с покрытием в силиконовый коврик и закрепите коврик в крышке колышка, как показано на рисунке 1.
   2. Накройте нижнюю сторону колышки / силиконового коврика (прикрепленного к основанию колышка) автоклавируемой лентой, чтобы колышки оставались на месте. Поместите колышковую крышку в герметичный автоклавируемый пакет и простерилизуйте в автоклаве перед использованием.
      ЗАМЕТКА: Колышки в крышке штифта будут помещаться в 96-луночный планшет в одной единственной ориентации. После заклеивания штифта скотчем проверьте выравнивание колышков в запасной 96-луночной пластине и наклейте соответствующую маркировку автоклавной ленты с правильной ориентацией крышки.

3. Прививка моделей

1. Подготовка бактериального посева
   1. Приготовьте в течение ночи культуры испытуемых бактериальных изолятов, суспендируя целую петлю бактериальных колоний, выращенных на твердой среде, в 10 мл бульона Лурия-Бертани (LB). Инкубировать в течение ночи (18 ч) при 37 °C с перемешиванием.
      ЗАМЕТКА: Для использования в модели биопленки Flexipeg рекомендуется использовать как минимум три биологические реплики.
   2. Нормализуйте культуры до наружного диаметра_{600 нм}0,1 (приблизительно 10⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл после разведения в планшетах) в конечном объеме 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
2. Установка микропланшетов и инокуляция
   1. Аликвота 135 мкл объединенной человеческой мочи (ФЕ) в каждую испытуемую лунку в 96-луночном планшете в соответствии с расположением планшетов на рисунке 1 (8). Каждая лунка представляет одну техническую реплику (минимум n = 3 технических репликации требуется на одну биологическую реплику).
      ЗАМЕТКА: По желанию пользователя вместо PHU могут использоваться искусственные мочевые среды (AUM).
   2. Инокулируйте каждую лунку в тестовую лунку 15 мкл нормализованной культуры в течение ночи, в результате чего конечный объем лунки составит 150 мкл. Оставьте не менее 100 мкл нормализованной культуры в течение ночи для серийных разведений с целью валидации КОЕ/мл инокулюма.
   3. Приготовьте отрицательный контроль, закачивая 150 мкл стерильного PUE только в соответствующие лунки.
   4. После установки микропланшета вставьте штифты в соответствующие лунки (как определено перед стерилизацией штифтов в автоклаве) и убедитесь, что крышка штифта находится заподлицо с поверхностью пластины. Накройте колышковую крышку крышкой микропланшета, при необходимости удерживая ее на месте автоклавной лентой.
   5. Поместите модели с колышками в герметичную пластиковую ванну/пакет с влажным синим рулоном, чтобы предотвратить испарение, и статически инкубируйте в течение 24 часов при температуре 37 °C.
3. Валидация инокулюма
   1. Добавьте 180 мкл PBS в ряды 2-6 первого столбца 96-луночного микропланшета и добавьте зарезервированные 100 мкл нормализованной ночной культуры в первую лунку.
   2. Удалите 20 μL нормализованной культуры на ночь из первой лунки и аликвоту во вторую лунку, аккуратно пипетируя вверх и вниз для смешивания.
   3. Повторяйте шаг 3.3.2 до тех пор, пока исходный инокулюм не будет разбавлен до конечной лунки (1 × 10⁵).
   4. Нанесите 10 мкл пятен каждого разведения на соответствующие твердые среды в трех экземплярах. Статически инкубировать в течение ночи при 37 °C.
   5. После инкубации подсчитайте количество колоний в каждом месте, чтобы рассчитать фактическое количество КОЕ/мл инокулята.

4. Количественное определение биопленки

1. Обработка колышков
   1. После инкубации извлеките модель колышка из микропланшета и переверните ее под огнем или в шкафу для микробиологической безопасности (колышками вверх). Выбросьте микропланшеты.
   2. Перенесите колышковую крышку на свежую микропланшет, содержащую 180 мкл аликвот стерильного PBS, чтобы удалить все неприлипшие клетки. Повторите дважды в свежем PBS, всего три этапа стирки.
      ЗАМЕТКА: Чтобы предотвратить повреждение поверхностно-ассоциированных биопленок, избегайте разрушения колышков при снятии колышки с каждой микропластины (т. е. касания краев лунки).
2. Перечисление КОЕ/мл (связанное с биопленкой)
   1. Работая асептически под пламенем или в шкафу с микробиологической безопасностью, установите штатив для пробирок (изготовленный на шаге 1.2.) со стерильными стеклянными пробирками, как показано на рисунке 1, и прикрепите верхнюю часть штатива, которая подходит к крышке штифта.
   2. Асептически аликвотировать 600 мкл стерильного PBS в каждую пробирку.
   3. Поместите крышку с колышками в решетку так, чтобы колышки находились на одной линии с трубками в решетке. Снимите автоклавную ленту с крышки колышка.
   4. С помощью стерильных щипцов протолкните колышки через крышку колышка в соответствующие пробирки, расположенные ниже.
   5. Установите на место крышки пробирок и ввергните каждую пробирку в вихрь в течение 60 с, чтобы отделить клетки, связанные с биопленкой, от поверхности штифта.
   6. Удалите 100 мкл из каждой пробирки и последовательно разбавьте, как описано ранее на шаге 3.3, в стерильном PBS.
   7. С помощью серологической пипетки вносите 10 мкл пятен каждого разведения на соответствующую твердую среду и инкубируйте статически при 37 °C в течение ночи.
   8. После инкубации подсчитайте количество колоний на каждой разбавляющей пластине и используйте его для расчета КОЕ/мл.
3. Окрашивание в кристально-фиолетовый цвет
   1. Аликвота 180 мкл 0,1% (мас./об.) кристаллического фиолета (в стерильной воде) в 24 испытательные лунки 96-луночного микропланшета.
   2. Вставьте промытую модель колышка (колышки и крышку колышка) в соответствующие лунки микропланшета. Статически инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут.
   3. После инкубации извлеките модель колышка из микропланшета и выбросьте микропланшет.
   4. В ванне подходящего размера промойте весь установленный колышек в водопроводной воде, осторожно помешивая. Повторите три раза.
   5. Переверните модель колышка и дайте колышкам полностью высохнуть при RT.
   6. Аликвотировать 180 мкл 30% уксусной кислоты в свежий 96-луночный микропланшет и вставить высушенную колышковую модель в соответствующие лунки. Инкубировать при RT в течение 30 минут.
   7. Снимите модель колышка с микропланшета и считайте наружный диаметр_{540 нм} окрашенных лунок с помощью считывателя микропланшетов или спектрофотометра.
   8. Чтобы рассчитать образование биопленки на колышках, усредните внешний диаметр_{540 нм} окрашенных отрицательных контрольных колышков и вычтите из среднего значения тестовых колышков.

Результаты

Рисунок 1: Схематическое изображение настройки модели Flexipeg. (1) Одиночный Flexipeg, покрытый полидиметилсилоксаном (PDMS) для имитации поверхности мочевого катетера для образования биопленки. (2) Устройство для создания биопленки Flexipe...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
96-луночные микропланшеты	Грейнер	650161	U-образное/круглое дно.
Уксусная кислота	Технология SLS	695092-2.5ЛСИГ	≥ 99,7% реагент ACS.
Кристально-фиолетовый	Мерк	61135-25Г
Индивидуальный колышек	Внутри компании	Компоненты Flexipeg будут напечатаны на 3D-принтере	Аддитивное производство с использованием устойчивой к высоким температурам смолы (требуется 24 штифта для каждой модели Flexipeg). Изготовлено с использованием высокотемпературной смолы Formlabs компании Protolabs (NL).
Бульон Лурия-Бертани (LB)	Неоген	NCM0088B	ЛБ бульон (Миллера).
Крышка, которая подходит для пластины на 96 лунок	Внутри компании	Компоненты Flexipeg будут напечатаны на 3D-принтере	Аддитивное производство с использованием устойчивой к высоким температурам смолы.
Форма для подготовки силиконового коврика	Внутри компании	Компоненты Flexipeg будут напечатаны на 3D-принтере	Аддитивное производство из любого прочного материала. Изготовлен с использованием смолы для прототипирования ABS компанией Protolabs (NL).
Форма для подготовки силиконового коврика боковой	Внутри компании	Компоненты Flexipeg будут напечатаны на 3D-принтере	Аддитивное производство из любого прочного материала.
Фосфатно-солевой буфер	Мерк	П4417-50ТАБ
Скопление человеческой мочи	-	-	Собрано у здоровых доноров после этического одобрения центрального университетского комитета по этике исследований.
Штатив для стеклянных пробирок	Внутри компании	Компоненты Flexipeg будут напечатаны на 3D-принтере	Аддитивное производство из любого прочного материала.
Силикон (PDMS)	MB Стекловолокно	ГП3481-Ф	Polycraft общего назначения RTV для конденсационного отверждения формы для производства силиконового каучука.
Верх, который подходит к колышковой крышке	Внутри компании	Компоненты Flexipeg будут напечатаны на 3D-принтере	Аддитивное производство с использованием устойчивой к высоким температурам смолы.
Катетеры Фолея	Грейт Беар Хэлскеа Великобритания Лтд		14 каналов, 100% силикон