Очистка содержащих геном аденовирусных векторов с помощью хлорида цезия

Аннотация

Источник: Эрке-Шульц Э., и др.Клонирование и крупномасштабное производство высокоемких аденовирусных векторов на основе аденовируса человека 5-го типа. J. Vis. Exp. (2016)

В данном видео демонстрируется очистка высокоемких аденовирусных векторов с помощью ультрацентрифугирования в градиенте хлорида цезия, что позволяет выделить вирионы, содержащие геном, для использования в доставке генов, характеристике векторов и доклинических терапевтических исследованиях

Протокол

1. Очистка и диализ HCAdV (высокоемких аденовирусных векторов)
   1. Для подготовки вирусного лизата для градиентов хлорида цезия (CsCl) заморозьте суспензию клеток и вируса в жидком азоте и разморозьте на водяной бане при 37 °C 4 раза.
   2. Центрифугируйте вирусный лизат при 500 x g в течение 8 мин при RT (комнатной температуре) и соберите супернатант, содержащий HCAdV (высокоемкие аденовирусные векторы).
   3. Для ультрацентрифугирования приготовьте растворы CsCl следующим образом. Взвесьте соответственно 37,5 г (для 1,5 г/см³), 33,5 г (для 1,35 г/см³) и 31,25 г (для 1,25 г/см³) порошка CsCl и доведите объем дистиллированной водой (dH₂O) до 25 мл.
      1. Перемешивайте до полного растворения и подвергните растворы стерилизующей фильтрации. В конце отберите по 1 мл каждого раствора и взвесьте на точных весах, чтобы проверить плотность. Масса 1 мл должна составлять соответственно 1,5 г, 1,35 г и 1,25 г.
      2. Если плотность слишком высока, скорректируйте ее путем ступенчатого добавления небольших объемов (µl) стерильной dH₂O. После добавления dH₂O снова измерьте плотность. При необходимости добавьте еще dH₂O.
      3. Повторяйте процедуру до достижения нужной плотности. Если плотность слишком низкая, скорректируйте ее, добавив небольшое количество порошка CsCl. Снова проведите стерилизующую фильтрацию и проверьте плотность. Если плотность стала слишком высокой, скорректируйте ее добавлением dH₂O, как описано выше. Если плотность все еще слишком низкая, добавьте еще CsCl, снова отфильтруйте и проверьте плотность. Повторяйте процедуру до получения точного значения плотности.
   4. Приготовьте ступенчатые градиенты CsCl в 6 прозрачных ультрацентрифужных пробирках. Осторожно и медленно внесите растворы CsCl в пробирки в следующем порядке: 0,5 мл раствора CsCl 1,5 г/см³, 3 мл раствора CsCl 1,35 г/см³ и 3,5 мл раствора CsCl 1,25 г/см³ (Рисунок 1C).
   5. Нанесите сверху на слой CsCl 1,25 г/см³ около 4,5 мл очищенного супернатанта вектора из этапа 1.2. Центрифугируйте градиенты в ультрацентрифуге с использованием качающегося ротора (SW-41) при 12 °C в течение не менее 2 ч при 226,000 x g (35,000 об/мин) с медленным ускорением и замедлением, чтобы отделить вирусные частицы, содержащие геном HCAdV, от пустых частиц и клеточного дебриса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При оптимальных условиях в верхней части пробирок образуется диффузная полоса клеточного дебриса. Ниже можно наблюдать две белые полосы. Верхняя полоса содержит пустые частицы, тогда как нижняя полоса соответствует HCAdV (Рисунки 1C и 2A).
   6. Осторожно удалите слои клеточного дебриса и пустых частиц, соберите по 1 мл из нижних полос каждой пробирки и перенесите вирус чистым наконечником пипетки в стерильную пробирку объемом 50 мл. Добавьте к собранным вирусным частицам до 24 мл раствора CsCl 1,35 г/см³ и осторожно перемешайте.
   7. Заполните центрифужные пробирки раствором CsCl-вируса 1,35 г/см³ доверху и центрифугируйте O/N (оночь) (18-20 ч) при 226,000 x g (35,000 об/мин) при 12 °C в ультрацентрифуге с использованием качающегося ротора (SW-41) с медленным ускорением и замедлением.
   8. Соберите HCAdV, находящийся в выраженной нижней полосе. Поскольку возможная верхняя полоса содержит пустые частицы, удалите верхние слои с помощью пипетки (см. Рисунки 1C и 2B). Затем извлеките нижнюю полосу с помощью пипетки.
   9. Проведите диализ собранных вирусных частиц для замены буфера.
      1. Отрежьте полоску диализной трубки (MWCO: 50,000) длиной около 8 см, промойте ее стерильной dH₂O 3 раза. Затем закройте один конец диализной трубки пластиковым зажимом и перенесите собранный вирус из этапа 5.8 в трубку с помощью пипетки объемом 1 мл. Избегайте появления пузырьков воздуха внутри трубки и закройте ее с другого конца пластиковым диализным зажимом.
      2. Проводите диализ в 1 л диализного буфера (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10% глицерина и 1 mM MgCl₂ (хлорида магния) в деионизированной H₂O) в течение 2 ч при 4 °C при медленном перемешивании. Замените диализный буфер на 2 л свежего диализного буфера и проводите диализ O/N при 4 °C при медленном перемешивании. В качестве альтернативы используйте сахарозный буфер (140 mM NaCl (хлорида натрия), 5 mM Na₂HPO₄.2H₂O (гидрофосфата натрия), 1,5 mM KH₂PO₄ (дигидрофосфата калия) и 730 mM сахарозы, pH 7,8).
      3. Соберите диализованные вирусные частицы из этапа 1.9.2 с помощью пипетки объемом 1 мл. Приготовьте несколько аликвот требуемого малого объема (25-100 µl) и храните очищенный вирус при -80 °C.

Результаты

Рисунок 1. Репрезентативные результаты процедуры клонирования и вырезания генома HCAdV (высокоемких аденовирусных векторов) из pAdVFTC. (A) Вырезание экспрессионной кассеты интересующего гена (GOI) из pHM5 путем рестрикции PI-SceI и I-CeuI. (B) очищенная экспрессионная кассета GOI и очищенный дефосфорилированный pAdVFTC, подвергнутые рестрикции PI-SceI и I-CeuI соответственно. (C) Аналитическая рестрикция клонов pAdVFTC с GOI и без него ферментом HincII. (D) Вырезание генома HCAdV, несущего GOI, из pAdVFTC-GOI путем рестрикции NotI

Рисунок 2. Репрезентативные результаты после центрифугирования в градиенте хлорида цезия (CsCl). (A) После проведения ступенчатого градиента (см. также шаг 1.5); (B) После непрерывного градиента (см. также шаг 1.7).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Пробирки для ультрацентрифуги Ultra Clear	Beckmann Coulter	344059	центрифугирование в градиенте плотности
Ультрацентрифуга	Beckmann Coulter		центрифугирование в градиенте плотности
Ротор SW-41	Beckmann Coulter		центрифугирование в градиенте плотности
Мембрана Spectrum Laboratories Spectrapor	VWR	132129	диализная трубка
Готовые к использованию диализные кассеты	Thermo	66383	диализ
Хлорид цезия	Carl Roth	8627.1	центрифугирование в градиенте плотности
Среда LB	Carl Roth	X968.3	среда для выращивания бактерий
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	диализный буфер / буфер для лизиса
Глицерин 99.5%	Carl Roth	3783.1	диализный буфер
MgCl₂ 98.5%	Carl Roth	KK36.2	диализный буфер
NaCl	Carl Roth	3957.1	дополнительный диализный буфер
KH₂PO₄	Carl Roth	3904.2	дополнительный диализный буфер
Сахароза	Carl Roth	9286.1	дополнительный диализный буфер
Na₂HPO₄·2H₂O	Carl Roth	4984.2	дополнительный диализный буфер
Пробирки 1.5 ml	sarstedt	72,730,005	хранение вирусных препаратов при -80 °C