Экспрессия вирусного трансгена в тканях желудочков грызунов ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомбинантный аденовирус или аденоассоциированный вирус (AAV), экспрессирующий целевой ген, и соответствующий контрольный вирус, например Ad-GFP (зеленый флуоресцентный белок) (титр 1 x 10¹⁰ бляшкообразующих единиц [БОЕ]/мл) или AAV9-GFP (титр 1 x 10¹³ геномных копий [ГК]/мл) (см. Таблицу материалов), следует хранить в морозильнике при температуре −80 °C. В день инъекции вируса разморозьте вирус на льду. Наберите вирус, экспрессирующий целевой ген, и контрольный вирус в два отдельных шприца (объем = 50 мкл) с иглами 30G ½ и держите на льду до использования. ПРИМЕЧАНИЕ: Все пузырьки воздуха в шприце и игле должны быть осторожно удалены. Введите крысам или мышам бупренорфин (0,05 мг/кг для крыс, 0,1 мг/кг для мышей, подкожно), через час введите в состояние наркоза с помощью 3% изофлурана и поддерживайте концентрацию изофлурана на уровне 2% (в 100% кислороде при скорости потока 0,5–1,0 л/мин) на время последующей процедуры. Осторожно зажмите тело животного (например, хвост) пинцетом; если животное не реагирует на зажим никакими движениями тела, надлежащая анестезия подтверждена. Поддерживайте температуру тела на уровне 37 °C с помощью электрической грелки. Сбрейте шерсть в области груди с помощью машинки для стрижки. ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании электрической грелки следует соблюдать осторожность из-за возможного неравномерного распределения тепла. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза для предотвращения пересыхания роговицы. Поместите животное в положение на спине и используйте систему доклинической визуализации (см. Таблицу материалов) для ультразвукового исследования сердца животного в короткой оси. ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы выполняются в боксе биологической безопасности II уровня, обеспечивающем стерильную среду. Применяются стандартные процедуры безопасности, включая правила безопасного обращения с иглами. Стерилизуйте левую нижнюю область грудной клетки животного, трижды по кругу чередуя обработку скрабом на основе йода или хлоргексидина и спиртом. Под контролем ультразвуковой визуализации введите иглу 30G 1/2 шприца с вирусом, подготовленным на этапе 1.1, в грудную клетку животного через левую нижнюю сторону груди. Подведите кончик иглы к передней свободной стенке левого желудочка и медленно введите 10–15 мкл вируса. Подтвердите успешность инъекции по изображениям УЗИ по усилению яркости рядом с кончиком иглы. ПРИМЕЧАНИЕ: Количество вируса, вводимого в каждую точку, не должно превышать 15 мкл во избежание физического повреждения тканей миокарда. Извлеките иглу из сердца и введите ее в другие области левого желудочка для второй и третьей инъекции того же количества вируса. ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество точек инъекции определяется дизайном эксперимента. Если требуется фокальная экспрессия трансгена, достаточно одной инъекции; если требуется более диффузная экспрессия трансгена, обычно требуется несколько точек инъекции (от трех до пяти). После завершения инъекций верните животное в клетку. Внимательно наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не восстановит сознание в степени, достаточной для поддержания положения лежа на груди, после чего верните его в помещение для содержания. В течение следующих 2 дней вводите животному гидрохлорид бупренорфина (0,1 мг/кг дважды в день для мышей, 0,05 мг/кг дважды в день для крыс, подкожно). Верните животных в виварий и ежедневно наблюдайте за любыми необычными признаками боли или стресса; при их обнаружении лечите животных в соответствии с протоколами институционального комитета по уходу за животными. Лу А., и др. Вирусная экспрессия трансгена в сердцах грызунов и оценка риска развития сердечной аритмии. J. Vis. Exp. (2022)
В видео демонстрируется метод внутримиокардиального введения рекомбинантного вирусного вектора под контролем УЗИ на модели мыши. Данная техника обеспечивает направленную доставку генов в сердце для изучения влияния экспрессии трансгена на функцию сердца.
