1. Трансдукция рецеллюляризированной печени крысы Крупномасштабное производство вирусного вектора на основе аденоассоциированных вирусов (AAV-вектор) Получение, очистка и количественное определение AAV-векторов: Вкратце: AAV-векторы получают в роллерах-флаконах и очищают методом центрифугирования в градиенте иодиксанола. Остатки иодиксанола удаляют путем фильтрации через гель-фильтрационные колонки PD10. Концентрацию AAV-вектора определяют методом количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР), используя геномную ДНК AAV в качестве стандарта. ПРИМЕЧАНИЕ: Самокомплементарный псевдотипированный вектор AAV2/6, использованный в данном исследовании, кодировал изумрудно-зеленый флуоресцентный репортерный белок EmGFP для демонстрации эффективности трансдукции и кассету экспрессии короткой шпилечной РНК (shRNA) для нокдауна эндогенно экспрессируемого гена (человеческого циклофилина B (hCycB), Рисунок 1). Убедитесь в наличии достаточного количества псевдотипированных scAAV-векторов серотипа 6 (2,7 x 10¹³ AAV-векторов на одну модель печени). Трансдукция модели печени Доведите раствор AAV-вектора до конечной концентрации 2,7 x 10¹³ векторных геномов в 5 мл, добавив соответствующий объем фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). Отсоедините печень от контура подачи среды, извлекая трубку из канюли. Подсоедините шприц объемом 5 мл к канюле воротной вены и введите весь объем раствора AAV-вектора (5 мл). ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости добавьте феноловый красный (5 мкг/мл), чтобы отследить распределение раствора AAV-вектора по всей печени. Инкубируйте в течение 1 часа без перекачивания. Постепенно увеличивайте скорость потока: 1,25 мл/мин в течение 10 мин; 2,5 мл/мин в течение 20 мин и 3,75 мл/мин в течение 30 мин. Культивируйте рецеллюляризированную печень крысы в течение 6 дней. 2. Оценка рецеллюляризированной трансдуцированной печени крысы Окрашивание гематоксилином и эозином (Г&Э) и иммуногистохимический анализ С помощью скальпеля возьмите образцы (0,5 x 0,5 x 1,5–2 см) из каждой доли печени. Инкубируйте образцы в растворе 4% параформальдегида (PFA) + 4% сахарозы в течение 1,5 ч при 4 °C. (Осторожно: PFA токсичен и канцерогенен. Всегда работайте с PFA в вытяжном шкафу и используйте соответствующие средства индивидуальной защиты). Трижды промойте PBS (по 1 мин на каждый этап промывки) и инкубируйте в 8% растворе сахарозы в течение ночи при 4 °C. Залейте фиксирующий агент в пластиковые криоформы и поместите в него образцы, избегая образования пузырьков воздуха. Добавьте фиксирующий агент так, чтобы образец был полностью покрыт. Храните залитые образцы при -80 °C до дальнейшего использования. Приготовьте криосрезы (10 мкм) с помощью криостата. Оцените рецеллюляризацию с помощью окрашивания гематоксилином и эозином. Оцените эффективность трансдукции с помощью иммуногистохимического окрашивания на целевой ген (в данном случае EmGFP). Хиллер, Т. и др. Изучение вирусных векторов в трехмерной модели печени, репопулированной линией клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2. J. Vis. Exp. (2016)
В данном видео демонстрируется иммуногистохимическое окрашивание для оценки переноса вирусного гена в модели рецеллюляризированной печени крысы. Экспрессия репортера, подтвержденная с помощью антител и колокализации с ядерным окрашиванием, указывает на успешную вирусную трансдукцию клеток.
