Создание стабильно трансдуцированных клеточных линий Высейте клетки колоректального рака HCT116 и клетки рака молочной железы MDA-MB-231 с плотностью 50 000 клеток на лунку в 12-луночный планшет с модифицированной средой Игла в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина (Pen/Strep). Инкубируйте при 37 °C и 5% CO2 до достижения клетками 60–70% конфлюэнтности. Промойте клетки фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), добавьте к раковым клеткам 1 мл среды, содержащей вирус, и инкубируйте в течение ночи при 37 °C и 5% CO2. В качестве контроля в две лунки с раковыми клетками добавьте 1 мл свежей среды DMEM с 10% FBS и 1% Pen/Strep. Осторожно удалите среду, содержащую вирус, путем аспирации. Промойте клетки PBS и замените среду на DMEM с 10% (об/об) FBS, не содержащей тетрациклина (Tet-free), и 1% Pen/Strep. Через 72 ч промойте клетки PBS и замените среду на DMEM с 10% Tet-free FBS, 1% Pen/Strep и 1 мкг/мл пуромицина для селекции вирус-трансдуцированных клеток. В зависимости от используемой клеточной линии скорректируйте концентрацию пуромицина для оптимальной селекции, протестировав диапазон концентраций пуромицина (0,1; 0,5; 1; 2 и 5 мкг/мл) на нетрансдуцированных клетках и выбрав минимальную концентрацию, при которой контрольные клетки не выживают после 3 дней культивирования. Проведите селекцию вирус-трансдуцированных клеток, культивируя их в присутствии пуромицина в течение 3–14 дней. В качестве контроля подготовьте две дополнительные лунки с нетрансдуцированными клетками: одну со средой, содержащей пуромицин, и одну без пуромицина. В лунке с вирус-трансдуцированными клетками наблюдается частичная гибель клеток под действием пуромицина по сравнению с контрольными лунками. ПРИМЕЧАНИЕ: Нетрансдуцированные клетки не будут расти в присутствии пуромицина. Проверьте эффективность условного нокдауна (KD) в пуромицин-резистентных клетках колоректального рака HCT116 и клетках рака молочной железы MDA-MB-231. ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективная концентрация доксициклина будет варьироваться в зависимости от используемой клеточной линии и должна быть подобрана путем титрования (обычно от 100 нг/мл до 2 мкг/мл). Определите концентрацию доксициклина, которая не является токсичной для клеток, но эффективно снижает экспрессию интересующего белка. В данном протоколе in vitro успешно использовалась концентрация 1 мкг/мл. Культивируйте клетки в течение 72 ч в присутствии и отсутствии доксициклина в концентрациях 0,1, 1 и 2 мкг/мл. Проверьте уровень экспрессии подавленного белка (в данном случае ингибитора активатора плазминогена-1 (PAI-1)) в клеточном лизате с помощью вестерн-блоттинга. Сравните клетки HCT116 и MDA-MB-231, условно экспрессирующие короткие шпилечные РНК (shRNA), с контрольными клетками, трансдуцированными скремблированной последовательностью. Кубала, М. Х. & DeClerck, Y. A. Условный нокдаун экспрессии генов в клеточных линиях рака для изучения рекрутирования моноцитов/макрофагов в микроокружение опухоли. J. Vis. Exp. (2017)
В данном видео демонстрируется создание линий раковых клеток с условным нокдауном с использованием Tet-индуцибельной лентивирусной системы shRNA. В нем подробно описаны этапы вирусной трансдукции, антибиотического отбора и индуцированного доксициклином сайленсинга генов.
