Приготовление вирус-обогащенной суспензии методом ступенчатого центрифугирования в сахарозе

Аннотация

Концентрирование вирусных частиц методом ультрацентрифугирования ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем метод двухэтапной очистки с сахарозой, который включает два этапа: этап центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и этап центрифугирования на подушке из сахарозы (Рисунок 1). Заполните конические пробирки для ультрацентрифугирования в следующем порядке для создания градиента сахарозы: 0,5 мл 70% сахарозы (растворенной в 1x фосфатно-солевом буферном растворе [PBS]), 0,5 мл 60% сахарозы (растворенной в DMEM), 1 мл 30% сахарозы (растворенной в модифицированной среде Игла в модификации Дульбекко [DMEM]) и 2 мл 20% сахарозы (растворенной в 1x PBS). Осторожно добавьте супернатант, содержащий вирус, в градиент. Поскольку общий объем супернатанта с четырех планшетов диаметром 15 см составляет 100 мл, для обработки всего объема вирусного супернатанта используйте шесть пробирок для ультрацентрифугирования за один цикл. Каждая пробирка для ультрацентрифугирования, используемая на данном этапе, имеет максимальный объем до 30 мл (включая объем сахарозы). Распределите вирусный супернатант по пробиркам поровну, оставляя не менее 10% свободного пространства сверху для предотвращения выливания. При использовании более четырех планшетов диаметром 15 см для каждого эксперимента доведите объем культуры до ~20–22 мл на планшет, чтобы конечный объем объединенного вирусного супернатанта мог легко поместиться в шести пробирках для ультрацентрифугирования. Заполняйте пробирки для ультрацентрифугирования не менее чем на три четверти их общего объема, иначе во время центрифугирования возможен разрыв пробирок, что может привести к потере образца и/или повреждению оборудования. Сбалансируйте пробирки с помощью 1x PBS и центрифугируйте образцы при 70 000 x g в течение 2 ч при 17 °C. ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить нарушение слоя сахарозы при ускорении, настройте ультрацентрифугу на медленный разгон ротора до 200 об/мин в течение первых 3 мин центрифугирования. Аналогично, настройте ультрацентрифугу на медленное замедление ротора с 200 об/мин до 0 об/мин в течение 3 мин в конце центрифугирования. Осторожно соберите фракции 30–60% сахарозы в чистые пробирки (Рисунок 1). Добавьте холодный 1x PBS к объединенным фракциям и доведите объем до 100 мл; перемешайте, несколько раз пропустив раствор через пипетку. Переходите к этапу центрифугирования на подушке из сахарозы, осторожно наслаивая вирусный препарат на подушку из сахарозы. Для этого добавьте в пробирку 4 мл 20% сахарозы (в 1x PBS), затем добавьте ~20–25 мл вирусного раствора в каждую пробирку. Если пробирки заполнены менее чем на три четверти, долейте стерильный 1x PBS. Тщательно сбалансируйте и центрифугируйте образцы при 70 000 x g в течение 2 ч при 17 °C, как и ранее. Слейте супернатант и дайте оставшейся жидкости стечь, перевернув пробирки на бумажные полотенца. Аспирируйте оставшиеся капли, чтобы полностью удалить жидкость из осадка. На этом этапе осадки, содержащие вирус, должны быть едва заметны в виде маленьких полупрозрачных пятен. Ресуспендируйте осадки, добавив 70 мкл 1x PBS в первую пробирку и тщательно перемешав суспензию пипетированием, затем перенесите суспензию в следующую пробирку и перемешайте так же, как и ранее, продолжая до тех пор, пока все осадки не будут ресуспендированы. Промойте пробирки дополнительными 50 мкл холодного 1x PBS и перемешайте так же, как ранее. Убедитесь, что общий объем конечной суспензии составляет ~120 мкл и она выглядит слегка мутной; очистите ее центрифугированием при 10 000 x g в течение 30 с в настольной микроцентрифуге. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную пробирку, разделите на аликвоты по 10 мкл и храните при -80 °C. ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания образцов лентивируса. За исключением случаев, когда требуется центрифугирование, остальные этапы следует проводить в ламинарных шкафах для культуры тканей или в специально отведенных помещениях для работы с культурами тканей с соблюдением соответствующих мер биологической безопасности. Виджайрагхаван С. и Кантор Б. Протокол получения лентивирусных векторов с дефицитом интегразы для нокаута генов с помощью системы CRISPR/Cas9 в делящихся клетках. J. Vis. Exp., (2017)

В данном видео демонстрируется двухэтапный метод ультрацентрифугирования с использованием сахарозных градиентов и подушек для очистки и концентрирования вирусных частиц из супернатанта клеточной культуры. Эта процедура позволяет проводить разделение на основе плавучей плотности, обеспечивая выделение интактного вируса, подходящего для последующих применений.

Протокол

1. Концентрирование вирусных частиц путем ультрацентрифугирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем метод двойной очистки сахарозой, который включает два этапа: этап градиента сахарозы и этап сахарозной подушки (Рисунок 1).

1. Заполните конические ультрацентрифужные пробирки в следующем порядке для создания градиента сахарозы: 0,5 mL 70% сахарозы (растворенной в 1x фосфатно-солевом буферном растворе [PBS]), 0,5 mL 60% сахарозы (растворенной в DMEM), 1 mL 30% сахарозы (растворенной в модифицированной среде Игла в модификации Дульбекко [DMEM]) и 2 mL 20% сахарозы (растворенной в 1x PBS).
2. Осторожно добавьте супернатант, содержащий вирус, в градиент. Поскольку общий объем супернатанта с четырех чашек диаметром 15 cm составляет 100 mL, используйте шесть ультрацентрифужных пробирок за один цикл центрифугирования для обработки всего объема вирусного супернатанта.
   1. Каждая ультрацентрифужная пробирка, используемая на этом этапе, имеет объем до 30 mL (включая объем сахарозы). Распределите вирусный супернатант по пробиркам поровну, оставив не менее 10% свободного пространства сверху для предотвращения разлива.
   2. При использовании более четырех чашек диаметром 15 cm для каждого эксперимента доведите объем культуры до ~20 - 22 mL на чашку, чтобы конечный объем объединенного вирусного супернатанта мог легко поместиться в шесть ультрацентрифужных пробирок.
   3. Заполняйте ультрацентрифужные пробирки как минимум на три четверти их общего объема, иначе при центрифугировании может произойти разрыв пробирок, что приведет к возможной потере образца и/или повреждению оборудования.
3. Сбалансируйте пробирки с помощью 1x PBS и центрифугируйте образцы при 70,000 x g в течение 2 h при 17 °C
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить нарушение слоя сахарозы при ускорении, настройте ультрацентрифугу на медленный разгон ротора до 200 rpm в течение первых 3 min центрифугирования. Аналогично, настройте ультрацентрифугу на медленное замедление ротора с 200 rpm до 0 rpm в течение 3 min в конце цикла.
4. Осторожно соберите фракции 30 - 60% сахарозы в чистые пробирки (Рисунок 1). Добавьте холодный 1x PBS к объединенным фракциям и доведите объем до 100 mL; перемешайте, несколько раз пропипетировав раствор.
5. Перейдите к этапу с сахарозной подушкой, осторожно наслоив вирусную пробу на подушку из сахарозы. Для этого добавьте в пробирку 4 mL 20% сахарозы (в 1x PBS), затем ~20 - 25 mL вирусного раствора в каждую пробирку. Если пробирки заполнены менее чем на три четверти, долейте стерильный 1x PBS.
6. Тщательно сбалансируйте и центрифугируйте образцы при 70,000 x g в течение 2 h при 17 °C, как и прежде. Слейте супернатант и дайте оставшейся жидкости стечь, перевернув пробирки на бумажные полотенца.
7. Аспирируйте оставшиеся капли, чтобы удалить всю жидкость из осадка. На этом этапе вируссодержащие осадки должны быть едва заметны в виде маленьких полупрозрачных пятен.
8. Ресуспендируйте осадки, добавив 70 µL 1x PBS в первую пробирку и тщательно перемешав суспензию пипетированием, затем перенося суспензию в следующую пробирку и перемешивая так же, как и прежде, до тех пор, пока все осадки не будут ресуспендированы.
9. Промойте пробирки дополнительными 50 µL холодного 1x PBS и перемешайте так же, как прежде. Убедитесь, что общий объем конечной суспензии составляет ~120 µL и она выглядит слегка мутной; осветлите её центрифугированием при 10,000 x g в течение 30 s в настольной микроцентрифуге.
10. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную пробирку, разделите на аликвоты по 10 µL и храните их при -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания образцов лентивируса. За исключением случаев, когда требуется центрифугирование, остальные этапы следует проводить в ламинарных шкафах для культур тканей или в специально отведенных помещениях для работы с культурами тканей с соблюдением соответствующих мер биобезопасности

Результаты

Рисунок 1: Концентрирование вирусных частиц с использованием протокола с двойным сахарозным градиентом. Вирусные частицы, собранные из супернатанта (SN), наносятся на градиент сахарозы. Для создания градиента используются 70%, 60%, 30% и 20% растворы сахарозы. После центрифугирования частицы, собранные из фракций 30-60% сахарозы, затем наносятся на 20% сахарозную подушку и осаждаются. Конечный осадок, содержащий очищенные вирусные частицы, ресуспендируют в 1x PBS для дальнейшего использования.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Оборудование
Ультрацентрифуга Optima XPN-80	Beckman Coulter	A99839
Настольная центрифуга Allegra 25R	Beckman Coulter	369434
Конические пробирки для ультрацентрифугирования	Seton Scientific	5067
Адаптеры для конических пробирок	Seton Scientific	PN 4230
Ротор с качающимися стаканами SW32Ti	Beckman Coulter	369650
Конические центрифужные пробирки объемом 50 mL	Corning	430291
Пипетки для культур тканей, 25 mL	Corning	4489