Оценка титра лентивируса с помощью иммуноферментного анализа

Аннотация

Определение вирусных титров p24 (капсидного белка p24 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ)-1) — метод иммуноферментного анализа (ИФА) ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ проводится с использованием 96-луночных планшетов с высокой сорбционной способностью в соответствии с инструкциями программы по вакцинам против СПИДа NIH для набора реагентов для анализа захвата антигена p24 ВИЧ-1 (см. таблицу материалов) с внесенными модификациями. На следующий день трижды промойте лунки 20 мкл 0,05% раствора Tween 20 в холодном PBS (раствор PBS-T). Покройте планшет 10 мкл моноклональных антител к p24 в разведении 1:150 в 1х PBS и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. Для устранения неспецифического связывания заблокируйте планшет 20 мкл 1% BSA в PBS; промойте трижды 20 мкл 0,05% раствора Tween 20 в холодном PBS (раствор PBS-T) в течение не менее 1 ч при комнатной температуре. Подготовка образцов: для концентрированных препаратов вектора разведите 1 мкл образца в 100 раз, добавив 89 мкл dd-H2O и 10 мкл Triton X-10 (конечная концентрация 10%). Для неконцентрированных препаратов приготовьте образцы с десятикратным разведением (добавьте 80 мкл dd-H2O и 10 мкл Triton X-100 (конечная концентрация 10%) к 10 мкл образца). ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе образцы могут храниться при -20 °C в течение длительного периода времени для последующего использования. Приготовьте стандарты ВИЧ-1 путем двукратного серийного разведения (с начальной концентрацией 5 нг/мл). Разведите концентрированные образцы (из предварительно разведенных стоков 1:10) в среде RPMI 1640 (среда Института памяти Розуэлла Парка 1640), дополненной 0,2% Tween 20 и 1% BSA, для создания разведений 1:10 00, 1:50 0 и 1:250 00. Разведите неконцентрированные образцы (из предварительно разведенных стоков 1:10) в RPMI 1640, дополненной 0,2% Tween 20 и 1% BSA, для создания разведений 1:50, 1:250 и 1:12 50. Нанесите образцы на планшет в трех повторностях и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. На следующий день шесть раз промойте лунки и инкубируйте при 37 °C в течение 4 ч с 10 мкл поликлональных кроличьих антител к p24, разведенных 1:10 в RPMI 1640, 10% FBS, 0,25% BSA и 2% нормальной сыворотки мыши (NMS). Шесть раз промойте, как указано выше, и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч с козьими анти-кроличьими IgG с пероксидазой хрена, разведенными 1:10 00 в RPMI 1640, дополненной 5% нормальной сывороткой козы, 2% NMS, 0,25% BSA и 0,01% Tween 20. Промойте планшет, как указано выше, и инкубируйте с пероксидазным субстратом TMB (3,3′,5,5′-тетраметилбензидин) при комнатной температуре в течение 15 мин. Остановите реакцию, добавив 10 мкл 1 N HCl. Измерьте абсорбцию образцов при 450 нм с помощью планшетного ридера. Виджайрагхаван С., и др. Протокол получения интеграза-дефицитных лентивирусных векторов для нокаута генов с помощью системы CRISPR/Cas9 в делящихся клетках. J. Vis. Exp. (2017).

В данном видео демонстрируется использование метода p24 ELISA для определения вирусного титра лентивирусных векторов. Анализ включает лизис вирусных частиц для высвобождения p24, захват белка специфическими антителами и его детекцию с помощью системы с пероксидазой, которая вызывает измеряемое изменение цвета. Вирусный титр количественно определяется путем сравнения значений абсорбции образцов со стандартной кривой.

Протокол

1. Определение вирусных титров

1. Метод иммуноферментного анализа (ИФА) на p24 (капсидный белок p24 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ)-1) ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ проводится с использованием 96-луночных планшетов с высокой сорбционной способностью в соответствии с инструкциями программы по вакцинам против СПИДа NIH для набора реагентов для захвата антигена p24 ВИЧ-1 (см. Таблицу материалов) с внесенными модификациями.
   1. На следующий день трижды промойте лунки 20 µL 0,05% раствора Tween 20 в холодном PBS (раствор PBS-T). Покройте поверхность планшета 10 µL моноклональных антител к p24 в разведении 1:150 в 1x PBS и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
   2. Для устранения неспецифического связывания заблокируйте планшет 20 µL 1% BSA в PBS; трижды промойте 20 µL 0,05% раствора Tween 20 в холодном PBS (раствор PBS-T) в течение не менее 1 ч при комнатной температуре.
   3. Подготовка образцов: Концентрированные препараты вектора разводят в 100 раз: к 1 µL образца добавляют 89 µL dd-H20 и 10 µL Triton X-10 (конечная концентрация 10%). Для неконцентрированных препаратов готовят десятикратные разведения (к 10 µL образца добавляют 80 µL dd-H20 и 10 µL Triton X-10 (конечная концентрация 10%)). ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе образцы можно хранить при -20 °C в течение длительного времени для последующего использования.
   4. Подготовьте стандарты ВИЧ-1, используя двукратные серийные разведения (исходная концентрация 5 ng/mL).
   5. Разведите концентрированные образцы (из предварительно разведенных стоков 1:10) в среде RPMI 1640 (среда Roswell Park Memorial Institute 1640) с добавлением 0,2% Tween 20 и 1% BSA для получения разведений 1:10 0, 1:50 0 и 1:250 00. Разведите неконцентрированные образцы (из предварительно разведенных стоков 1:10) в среде RPMI 1640 с добавлением 0,2% Tween 20 и 1% BSA для получения разведений 1:50, 1:250 и 1:12 500.
   6. Нанесите образцы на планшет в трех повторностях и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
   7. На следующий день шесть раз промойте лунки и инкубируйте при 37 °C в течение 4 ч с добавлением 10 µL поликлональных кроличьих антител к p24, разведенных 1:10 в смеси RPMI 1640, 10% FBS, 0,25% BSA и 2% нормальной сыворотки мыши (NMS).
   8. Шесть раз промойте планшет, как описано выше, и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч с козьими анти-кроличьими IgG с пероксидазой хрена, разведенными 1:10 0 в среде RPMI 1640 с добавлением 5% нормальной козьей сыворотки, 2% NMS, 0,25% BSA и 0,01% Tween 20.
   9. Промойте планшет, как описано выше, и инкубируйте с субстратом пероксидазы TMB (3,3′,5,5′-тетраметилбензидин) при комнатной температуре в течение 15 мин.
   10. Остановите реакцию, добавив 10 µL 1 N HCL. Измерьте оптическую плотность образцов при 450 nm с помощью планшетного ридера.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагенты для p24 ELISA
Моноклональные антитела к p24	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3537
Стандарты HIV-1	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP968F
Поликлональные кроличьи антитела к p24	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP451T
Козьи антитела против кроличьих IgG с пероксидазой хрена	Sigma Aldrich	12-348	Рабочая концентрация 1:150
Нормальная сыворотка мыши, стерильная, 50mL	Equitech-Bio	SM30-050
Сыворотка козы, стерильная, 10mL	Sigma	G9023	Рабочая концентрация 1:10
TMB-субстрат для пероксидазы	KPL	5120-076	Рабочая концентрация 1:10,0