Получение рекомбинантного аденоассоциированного вируса путем трансфекции плазмидами

Аннотация

Трансфекция клеток HEK293 плазмидами рекомбинантного аденоассоциированного вируса 9 (rAAV9) Приготовьте раствор линейного полиэтиленимина (PEI) с концентрацией 1 мкг/мкл. Растворите порошок PEI в безэндотоксиновой воде dH2O, предварительно нагретой до 70–80 °C. После охлаждения до комнатной температуры доведите pH раствора до 7,0 с помощью 1 M HCl. Стерилизуйте раствор путем фильтрации (0,2 мкм). Разлейте исходный раствор PEI (1 мкг/мкл) по аликвотам (140 мкл на пробирку) и храните при -20 °C. Культивируйте клетки HEK293 в модифицированной среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина. Инкубируйте клетки при 37 °C в инкубаторе с содержанием углекислого газа (CO2) 5 ± 0,5%. В день 0, за 18–20 часов до трансфекции, высейте клетки HEK293 в десять чашек диаметром 150 мм, разделив клетки с конфлюэнтностью > 90% в разведении 1:2. ПРИМЕЧАНИЕ: К 1-му дню клетки должны достичь 90% конфлюэнтности. В день 1 проведите трансфекцию клеток HEK293 плазмидой rAAV9 (например, конструкциями rAAV9.cTNT::GFP или rAAV6.U6::shRNA), плазмидой Ad-Helper и плазмидой AAV-Rep/Cap, используя PEI. Для 10 чашек с клетками при 90% конфлюэнтности смешайте 70 мкг плазмиды AAV-Rep/Cap, 70 мкг плазмиды rAAV9 и 20 мкг плазмиды Ad-Helper в центрифужной пробирке объемом 50 мл. Если степень конфлюэнтности клеток ниже, пропорционально скорректируйте количество ДНК. Например, если конфлюэнтность составляет 75%, пропорционально уменьшите количество ДНК (75/90 от количества, указанного в пункте 1.4.1): смешайте в центрифужной пробирке объемом 50 мл 70 x 75/90 = 58,3 мкг плазмиды AAV-Rep/Cap, 70 x 75/90 = 58,3 мкг плазмиды rAAV9 и 20 x 75/90 = 16,7 мкг плазмиды Ad-Helper. Добавьте в пробирку объемом 50 мл 49 мл среды DMEM комнатной температуры (без FBS) и тщательно перемешайте. Добавьте 1360 мкл раствора PEI, чтобы соотношение PEI:ДНК (об/мас) составило 4:1. Тщательно перемешайте. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 15–30 мин. Добавьте по 5 мл смеси, приготовленной на этапе 1.4.4, в каждую чашку диаметром 150 мм (всего 50 мл смеси на десять чашек). Культивируйте клетки в инкубаторе при 37 °C и 5 ± 0,5% CO2 в течение 60–72 ч. Дин, Дж., и др.Подготовка rAAV9 для гиперэкспрессии или нокдауна генов в сердце мышей. J. Vis. Exp. (2016)

В данном видео демонстрируется получение частиц рекомбинантного аденоассоциированного вируса путем трансфекции плазмидами в клетки млекопитающих. Особое внимание уделяется скоординированной экспрессии белков Rep, Cap и хелперных белков, которые обеспечивают репликацию вирусного генома и сборку капсида в ядре.

Протокол

1. Трансфекция клеток HEK293 плазмидами рекомбинантного аденоассоциированного вируса 9 (rAAV9)

1. Приготовьте раствор линейного полиэтиленимина (PEI) в концентрации 1 µg/µl. Растворите порошок PEI в воде dH₂O, очищенной от эндотоксинов и нагретой до 70-80 °C. После охлаждения до RT доведите pH раствора до 7,0 с помощью 1 M HCl. Стерилизуйте раствор фильтрацией (0,2 µm). Разлейте исходный раствор PEI (1 µg/µl) по аликвотам (по 1 40 µl на пробирку) и храните при -20 °C.
2. Культивируйте клетки HEK293 в модифицированной среде Игла в модификации нельсона (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина. Инкубируйте клетки при 37 °C в инкубаторе с содержанием диоксида углерода (CO₂) 5 ± 0,5%.
3. На 0-й день, за 18-20 ч до трансфекции, высейте клетки HEK293 в десять 150-мм чашек, разделив клетки с конфлюэнтностью > 90% в разведении 1:2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: К 1-му дню клетки должны достичь 90% конфлюэнтности.
4. На 1-й день проведите трансфекцию клеток HEK293 плазмидой rAAV9 (например, конструктами rAAV9.cTNT::GFP или rAAV6.U6::shRNA), плазмидой Ad-Helper и плазмидой AAV-Rep/Cap, используя PEI.
   1. Для 10 чашек с клетками при 90% конфлюэнтности смешайте в центрифужной пробирке объемом 50 мл 70 µg плазмиды AAV-Rep/Cap, 70 µg плазмиды rAAV9 и 20 µg плазмиды Ad-Helper.
   2. Если конфлюэнтность клеток ниже, пропорционально скорректируйте количество ДНК. Например, при 75% конфлюэнтности уменьшите количество ДНК пропорционально (75/90 от количества, указанного в шаге 1.4.1): смешайте в центрифужной пробирке объемом 50 мл 70 x 75/90 = 58,3 µg плазмиды AAV-Rep/Cap, 70 x 75/90 = 58,3 µg плазмиды rAAV9 и 20 x 75/90 = 16,7 µg плазмиды Ad-Helper.
   3. Добавьте в пробирку 49 ml среды DMEM при RT (без FBS) и тщательно перемешайте.
   4. Добавьте 1 360 µl раствора PEI, чтобы отношение PEI:ДНК (v/w) составило 4:1. Тщательно перемешайте. Инкубируйте при RT в течение 15-30 мин.
   5. Добавьте по 5 ml смеси, приготовленной в шаге 1.4.4, в каждую 150-мм чашку (всего 50 ml смеси на десять 150-мм чашек).
5. Культивируйте клетки в инкубаторе при 37 °C и 5 ±0,5% CO₂ в течение 60-72 ч.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Полиэтиленимин, линейный (MW 25,00)	Polysciences, Inc.	#2396-2
Пробирка, полипропиленовая, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (кол-во 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
Среда DMEM	Fisher Scientific	SH30243FS
Фетальная бычья сыворотка	Atlanta Biologicals	S150
Вектор rAAV9	Penn Vector Core	P1967