Очистка рекомбинантных вирусных частиц из трансфицированных клеток почек человека

Аннотация

Источник: Дин Дж. и др., Подготовка rAAV9 для гиперэкспрессии или нокдауна генов в сердцах мышей. J. Vis. Exp. (2016)

В данном видео показана очистка рекомбинантных вирусных частиц из трансфицированных клеток почек человека. Вирус высвобождается путем лизиса при замораживании-оттаивании и очищается с использованием градиентов иодиксанола с фильтрацией при помощи блок-сополимера.

Протокол

1. Трансфекция клеток HEK293 плазмидами рекомбинантного аденоассоциированного вируса 9 (rAAV9)
   1. Приготовьте раствор линейного полиэтиленимина (PEI) с концентрацией 1 µg/µl. Растворите порошок PEI в безэндотоксинной dH₂O, предварительно нагретой до 70-80 °C. После охлаждения до комнатной температуры (RT) доведите pH раствора до 7.0 с помощью 1 M соляной кислоты (HCl). Стерилизуйте раствор путем фильтрации (0.22 µm). Разлейте стоковый раствор PEI (1 µg/µl) по аликвотам (1,400 µl/пробирка) и храните при -20 °C.
   2. Культивируйте клетки HEK293 в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина. Инкубируйте клетки при 37 °C в инкубаторе с содержанием диоксида углерода (CO₂) 5 ± 0.5%.
   3. В день 0, за 18-20 ч до трансфекции, посейте клетки HEK293 в десять 150-мм чашек, разделив клетки при слиянии > 90% в разведении 1:2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: К 1-му дню клетки должны достичь 90% слияния.
   4. В день 1 проведите трансфекцию клеток HEK293 плазмидой rAAV9 (например, конструкциями rAAV9.cTNT::GFP или rAAV6.U6::shRNA), плазмидой Ad-Helper и плазмидой AAV-Rep/Cap с использованием PEI.
      1. Для 10 чашек с клетками при 90% слиянии смешайте в 50-мл центрифужной пробирке 70 µg плазмиды AAV-Rep/Cap, 70 µg плазмиды pfrAAV9 и 200 µg плазмиды Ad-helper.
      2. Если степень слияния клеток ниже, пропорционально скорректируйте количество ДНК. Например, при слиянии 75% уменьшите количество ДНК пропорционально (75/90 от количества, указанного в шаге 2.4.1): смешайте в 50-мл центрифужной пробирке 70 x 75/90 = 58.3 µg плазмиды AAV-Rep/Cap, 70 x 75/90 = 58.3 µg плазмиды rAAV9 и 200 x 75/90 = 166.7 µg плазмиды Ad-Helper.
      3. Добавьте в 50-мл пробирку 49 мл DMEM комнатной температуры (без FBS) и тщательно перемешайте.
      4. Добавьте 1,360 µl раствора PEI, чтобы соотношение PEI:ДНК (v/w) составило 4:1. Тщательно перемешайте. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 15–30 мин.
      5. Добавьте по 5 мл смеси, приготовленной в шаге 1.4.4, в каждую 150-мм чашку (всего 50 мл смеси на десять 150-мм чашек).
   5. Культивируйте клетки в инкубаторе при 37 °C и 5 ±0.5% CO₂ в течение 60-72 ч.
2. Сбор трансфецированных клеток HEK293 и очистка векторов rAAV9
   1. Соберите клетки через 60-72 ч после трансфекции. Отделите клетки от поверхности и суспендируйте их в чашках, несколько раз прокачивая их пипеткой вместе с культуральной средой. Перенесите все клеточные суспензии в стерильные 50-мл пробирки.
   2. Центрифугируйте клетки при 500 x g в течение 5 мин. Ресуспендируйте клеточный осадок в каждой пробирке в 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) и объедините все суспензии в одну 50-мл пробирку.
   3. Центрифугируйте клетки при 500 x g в течение 5 мин. Удалите супернатант. На этом этапе клеточный осадок можно хранить при -80 °C или немедленно приступить к очистке AAV из осадка, как описано в шагах 2.4-2.15.
   4. Приготовьте лизирующий буфер: 150 mM хлорида натрия (NaCl) и 20 mM гидрохлорида трис(гидроксиметил)аминометана (Tris-HCl, pH 8.0). Стерилизуйте путем фильтрации (0.22 µM). Храните буфер при 4 °C.
   5. Ресуспендируйте осадок в 10 мл лизирующего буфера.
   6. Заморозьте лизат при -80 °C или в бане с сухим льдом и этанолом, затем разморозьте при 37 °C. Перемешайте на вортексе в течение 1 мин. Повторите цикл замораживания и размораживания лизата 3 раза.
   7. Добавьте в размороженный лизат раствор хлорида магния (MgCl₂) (до конечной концентрации MgCl₂ в лизате 1 mM). Добавьте нуклеазу до конечной концентрации 250 U/ml. Инкубируйте при 37 °C в течение 15 мин для растворения агрегатов ДНК/белков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если после обработки нуклеазой или эндонуклеазой агрегаты ДНК/белков не растворились, гомогенизируйте лизаты в гомогенизаторе Даунса 20 раз.
   8. Центрифугируйте образец при 4,800 x g в течение 20 мин при 4 °C. Соберите супернатант.
   9. Тем временем приготовьте раствор градиента иодиксанола:
      1. Приготовьте 17% раствор градиента, смешав 5 мл 10x PBS, 0.05 мл 1 M MgCl₂, 0.125 мл 1 M хлорида калия (KCl), 10 мл 5 M NaCl и 12.5 мл среды для градиента плотности. Доведите общий объем до 50 мл с помощью H₂O.
      2. Приготовьте 25% раствор, смешав 5 мл 10x PBS, 0.05 мл 1 M MgCl₂, 0.125 мл 1 M KCl, 20 мл среды для градиента плотности и 0.2 мл 0.5% (w/v) фенолового красного. Доведите общий объем до 50 мл с помощью H₂O.
      3. Приготовьте 40% раствор, смешав 5 мл 10x PBS, 0.05 мл 1 M MgCl₂, 0.125 мл 1 M KCl и 33.3 мл среды для градиента плотности. Доведите общий объем до 50 мл с помощью H₂O.
      4. Приготовьте 60% раствор, смешав 0.05 мл 1 M MgCl₂, 0.125 мл 1 M KCl, 50 мл среды для градиента плотности и 0.1 мл 0.5% (w/v) фенолового красного.
   10. С помощью иглы и шприца внесите раствор градиента иодиксанола в полипропиленовую пробирку, начиная снизу, в следующем порядке: 5 мл 17%, 5 мл 25%, 5 мл 40% и 5 мл 60%. Сверху на градиент нанесите весь лизат, полученный в шаге 3.8 (14-16 мл). Таким образом, градиент снизу вверх будет состоять из слоев 60%, 40%, 25%, 17% и слоя лизата. Заполните пробирку лизирующим буфером и закройте пробкой.
   11. Центрифугируйте при 185,000 x g в течение 90 мин при 16 °C.
   12. Соберите вирусную фракцию (40% слой) с помощью шприца. Введите иглу (21G) на границу раздела между 40% и 60% фракциями, аспирируя только 40% слой.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте аспирации 25% слоя.
   13. Смешайте вирусную фракцию со стерильным раствором PBS с полиоксиэтилен-полиоксипропиленовым блок-сополимером (стоковый раствор 10% полиоксиэтилен-полиоксипропиленового блок-сополимера, разведенный в PBS 1:10,000) до общего объема 15 мл. Перенесите смесь в фильтрующую пробирку (порог отсечения MW = 100 kD). Центрифугируйте при 2,000 x g в течение 30 мин при 4 °C.
   14. Удалите раствор из нижней части. Снова заполните фильтрующую пробирку раствором PBS с полиоксиэтилен-полиоксипропиленовым блок-сополимером до общего объема 15 мл. Центрифугируйте при 2,000 x g в течение 20 мин при 4 °C. Повторите этот шаг еще два раза. Соберите очищенный вирус rAAV9 (фракция над фильтром).
   15. Перенесите очищенный rAAV9 из фильтрующей пробирки в пробирки объемом 1.7 мл. Разлейте очищенный rAAV9 по аликвотам (100-400 µl/пробирка, в зависимости от объема и титра AAV) и храните вирус при -80 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторных циклов замораживания-размораживания.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Полиэтиленимин, линейный (MW 25,000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
Пробирка, полипропиленовая, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (кол-во 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
Нуклеаза, сверхчистая	SIGMA	#E8263-25KU
Среда для создания градиента плотности (йодиксанол)	SIGMA	#D1556-250ML
Центрифужный фильтр с мембраной Ultracel-100	EMD Millipore Corporation	#UFC910008
Лабораторная пипетировочная игла с тупым концом под углом 90°, калибр 14, длина 6 in., никелированный штуцер	SIGMA	#CAD7942-12EA
Раствор полоксамера 188 (раствор Pluronic® F-68)	SIGMA	P5556-100ML
Протеиназа K	SIGMA	3115828001
ДНКаза I	Roche	10104159001
Центрифуга	Thermo Scientific	75004260
Система центрифугирования	Beckman Coulter	363118
Ультрацентрифуга	Beckman Coulter
Среда DMEM	Fisher Scientific	SH30243FS
Фетальная бычья сыворотка	Atlanta Biologicals	S11150
Вектор rAAV9	Penn Vector Core	P1967