Трансдукция эндотелиальных клеток (ЭК) генами E6 и E7 папилломавируса. ПРИМЕЧАНИЕ: Для выращивания первичных ЭК мы обычно используем стандартные флаконы для культивирования тканей. Однако при неудовлетворительном росте ЭК следует рассмотреть возможность использования коммерческих флаконов для культивирования. Культивируйте первичные микрососудистые или лимфатические ЭК дермы человека в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в среде для роста ЭК (EGM; содержит базальную среду ЭК [EBM], дополненную набором EGM-2 BulletKit [содержащим фетальную бычью сыворотку, гидрокортизон, фактор роста фибробластов человека-B, фактор роста сосудистых ЭК, инсулиноподобный фактор роста-1, аскорбиновую кислоту, эпителиальный фактор роста человека, антибиотики и гепарин]) во флаконе для культивирования клеток T75 до достижения примерно 50% конфлюэнтности. Для трансдукции культивируйте клетки PA317 LXSN 16E6E7 в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в модифицированной среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и противомикробными препаратами, во флаконе для культивирования клеток T150 до достижения примерно 90% конфлюэнтности. Затем инкубируйте в течение ночи в 16 мл среды. Очистите среду PA317 путем центрифугирования при 300 × g в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалите EGM из культуры ЭК, залейте клетки 12 мл очищенной среды PA317 и инкубируйте в течение 4 ч. ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование 16 мл кондиционированной среды при 300 × g в течение 5 мин приводит к образованию плотного осадка, который не нарушается при последующем осторожном удалении 12 мл очищенного супернатанта. Однако если существует риск переноса клеток PA317 LXSN 16E6E7 в культуры первичных ЭК (линия упаковочных клеток быстро перерастет ЭК), перед переносом можно провести фильтрацию кондиционированного супернатанта через фильтр 0,45 мкм. Замените 6 мл среды PA317 свежей средой EGM и инкубируйте в течение ночи. Добавьте ЭК 12 мл свежей среды EGM и инкубируйте еще 48 ч. Для субкультивирования ЭК удалите среду, промойте 12 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) без катионов, добавьте 3 мл коммерческого раствора для ферментативной диссоциации (например, TrypLE) и инкубируйте при 37 °C в течение 3 мин. Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 300 × g в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируйте полученный клеточный осадок в свежей среде EGM и равномерно разделите на 3 флакона T75 с конечным объемом 12 мл EGM на флакон. Для селекции трансдуцированных E6 и E7 ЭК добавьте G418 до конечной концентрации 200 мкг/мл на два пассажа, после чего трансдуцированные ЭК можно высеять для инфицирования или заморозить в жидком азоте. МакАлистер С. К., Хансон Р. С., и др. Модель in vitro для изучения клеточной трансформации, индуцированной герпесвирусом ассоциированным с саркомой Капоши. J. Vis. Exp.(2017)
В данном видео демонстрируется ретровирусная трансдукция первичных эндотелиальных клеток онкогенами E6/E7 HPV16. Интегрированные онкогены инактивируют опухолевые супрессоры p53 и Rb, что увеличивает продолжительность жизни клеток. Селекция с помощью G418 позволяет обогатить культуру трансдуцированными клетками, что приводит к получению иммортализованных эндотелиальных культур, пригодных для исследований трансформации
