Определение распределения вирусной РНК в клетках хозяина методом флуоресцентной гибридизации in situ

Аннотация

Источник: Vallery, T. K. & Стейтц, Дж. А. Количественная флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и иммунофлуоресценция (IF) специфических продуктов генов в клетках, инфицированных KSHV. J. Vis. Exp. (2019)

В данном видео демонстрируется метод флуоресцентной гибридизации in situ для визуализации вирусной РНК в инфицированных вирусом клетках. В нем описываются этапы гибридизации зондов, усиления сигнала и конфокальной микроскопии.

Протокол

1. Фиксация, гибридизация и визуализация вирусных РНК

1. Удалите среду и избыток клеток. На протяжении всего протокола используйте вакуумный аспиратор для удаления растворов и осторожное микропипетирование для их добавления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Степень вакуума можно снизить, поместив 200 µL наконечник микропипетки над стеклянной пастеровской пипеткой. Заменяйте наконечник микропипетки между этапами промывки во избежание контаминации. Каждый этап промывки необходимо выполнять быстро, так как крайне важно не допускать высыхания клеток.
2. Немедленно зафиксируйте клетки, используя предварительно охлажденный 4% раствор формальдегида в PBS (фосфатно-солевом буфере), выдержав на льду в течение 30 мин. Промойте клетки трижды с помощью 200 µL 1x PBS, охлажденный до 4 °C инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре или на льду.
   1. Пермеабилизируйте фиксированные клетки с помощью 200 µL охлажденным 0,5% раствором Triton-X в PBS в течение 10 минут на льду или 750 µL охлажденного 70% этанола при 4 °C от 1 ч (мин.) до 7 сут. (макс.).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все промывки в данном протоколе выполняются одинаково, если не указано иное. 70%-й этанол размягчает клей между камерой и предметным стеклом, что облегчает их последующее разделение, а также обеспечивает значительную паузу в выполнении протокола. Тем не менее, используйте парафиновую пленку вокруг предметного стекла с камерой для уменьшения испарения и проверяйте уровень этанола в каждой камере примерно каждые 8 ч. 70%-й этанол также способствует распластыванию клеток, что делает изображение более четким, в то время как Triton-X не вызывает дегидратации клеток и не изменяет их размеры.
3. Осторожно снимите камеры, чтобы не допустить растрескивания предметного стекла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте новый инструмент для снятия или инструмент с минимальным количеством остаточного клея от производителя; осторожно снимите камеры, чтобы предотвратить растрескивание предметного стекла. Использование 70% этанола в качестве пермеабилизирующего реагента в течение 4 часов значительно снижает вероятность растрескивания. В случае появления трещины продолжайте выполнение протокола в тех камерах, которые не затронуты трещиной, и учитывайте более высокую скорость окисления на негерметично закрытых стеклах (т. е. сокращение срока хранения).
4. Однократно промойте клетки 2x SSC (солевым раствором цитрата натрия), после чего нанесите 45 µL гибридизационного раствора, состоящего из 50% формамида, 10% декстрансульфата, 2x SSC, 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 500 µg/mL дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) спермы лосося, 125 µg/mL E. coli транспортная РНК (тРНК) и 1 мМ комплексов ванадилрибонуклеозида. Инкубируйте в течение 1 ч при 37 °C в увлажненной камере, которой может служить чашка Петри диаметром 150 мм с влажными стерильными салфетками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежий гибридизационный раствор не менее чем за час до использования. Сначала растворите декстрансульфат в воде, часто перемешивая на вортексе и инкубируя в 37 °C водяная баня.
5. Рассчитайте количество олигонуклеотидов, необходимое для достижения рекомендуемой концентрации 25 µM в 35 µL гибридизационного раствора на одну камеру. При необходимости скорректируйте концентрацию антисмысловых олигонуклеотидов. Добавьте дистиллированную воду к олигонуклеотидам, чтобы довести объем для денатурации до 10 µL.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После реакции мечения олигонуклеотиды хранят в гасящем растворе, содержащем 0,18 M какодилата калия, 23 мМ Tris-HCl, 0,23 мг/мл BSA и 4,5 мМ CoCl2₂, 18 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 2,7 мМ фосфата калия и 6,8 мМ KCl, 45 µM 2-меркаптоэтанол, 0,02% Triton X-10 и 2% глицерин. Данные концентрации достаточно высоки, чтобы при разведении водой раствор для денатурации достиг концентраций, близких к 1x TE (10 мМ Tris-HCl и 1 мМ EDTA), который является стандартным буфером для денатурации олигонуклеотидов.
6. Денатурируйте олигонуклеотиды, меченные дигоксигенином (DIG) и/или Alexa Fluor 594, при 95 °C в течение 5 мин. Затем добавьте 35 µL свежий гибридизационный раствор в каждую соответствующую камеру к денатурированным олигонуклеотидам. При проведении двойной флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) оба набора антисмысловых олигонуклеотидов можно денатурировать и гибридизовать совместно.
7. Удалите раствор для прегибридизации, затем добавьте к клеткам гибридизационный раствор, содержащий меченые олигонуклеотиды. Инкубируйте в увлажненной камере в течение ночи при 37 °C алюминиевой фольгой для защиты олигонуклеотидов, меченных флуорофором.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация должна длиться не менее 10 и не более 24 ч.
8. На следующий день дважды промойте клетки 2x SSC в течение 10 мин при 37 °C затем дважды промывают 1x SSC в течение 10 мин при 25 °C.
9. Зафиксируйте клетки предварительно охлажденным 4% формальдегидом в 1x PBS в течение 10–15 мин на льду. Затем трижды промойте клетки PBS и проведите пермеабилизацию в течение 1 ч с использованием предварительно охлажденного 70% этанола или в течение 10 мин с использованием предварительно охлажденного 0,5% Triton-X в 1x PBS при 4 °C.
10. Инкубируйте клетки с антителами к дигоксигенину (DIG)–флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC) в разведении 1:200 в предварительно охлажденном 0,1% растворе BSA/1x PBS в течение 1 ч при 4 °CУдалите раствор антител и трижды промойте 1x PBS.
11. Фиксируйте в предварительно охлажденном 4% растворе формальдегида в 1x PBS в течение 10–15 мин при 4 °C затем трижды промойте 1x PBS.
12. Инкубируйте клетки с 0.4 µg/mL 4′, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) в предварительно охлажденном 0,5% растворе Triton-X в 1x PBS в течение 15 мин на льду, после чего трижды промыть 1x PBS.
13. Закрепите объектные стекла с помощью флуоресцентных микросфер (опционально) и заключающего средства. Затем загерметизируйте покровное стекло на предметном стекле прозрачным лаком для ногтей.
14. С помощью конфокального микроскопа получите изображения образцов с увеличением 630x в интервале от одного часа до одной недели после выполнения протокола. Нанесите несколько слоев лака для ногтей, чтобы загерметизировать покровное стекло и продлить срок службы флуорофора за счет снижения скорости окисления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте среду для заключения препаратов, содержащую DAPI. При съемке изображений добавляйте на каждое из них масштабную линейку для последующего количественного анализа. Флуоресцентные микросферы служат контролем интенсивности флуоресценции между разными предметными стеклами и образцами. Снимайте изображения на уровне срединной части клетки для проведения двумерного (2D) количественного анализа.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Anti-DIG FITC	Jackson Lab Immunologicals	20-092-156
Декстрансульфат	Sigma Aldrich	D8906	Степень чистоты для молекулярной биологии
Набор для DIG-олигонуклеотидного достроения	Sigma Roche	#0353583910	2-е поколение
Восьмилуночные предметные стекла	Nunc Lab Tek II	#15453	Синяя герметизация обеспечивает поверхностное натяжение, но также доступны варианты с разделением прозрачным гелем.
Формамид	Sigma Aldrich	F9037	Степень чистоты для молекулярной биологии
Ванадильные рибонуклеозидные комплексы	NEB	S1402S