1. Временное прямое подсчет спонтанной индукции (Рисунок 1) 1.1. Приготовьте ночные стартовые культуры лизогена (например, лизогена P. aeruginosa PAO1, несущего фаги LES (Liverpool Epidemic Strain)) и индикаторного хозяина (PAO1-RifR (рифампицин-резистентный Pseudomonas aeruginosa PAO1)), инокулировав одну колонию в 5 мл бульона LB (бульон Лурии-Бертани), и инкубируйте при 37 °C с перемешиванием при 180 об/мин (18–24 ч). 1.2. Приготовьте свежие культуры лизогена и индикаторного хозяина, инокулировав ночные культуры в 100 мл бульона LB в соотношении 1:100, и инкубируйте при 37 °C с перемешиванием (180 об/мин). 1.3. Контролируйте рост лизогена, измеряя OD600 и количество жизнеспособных клеток методом Майлза-Мисры. Для этого каждые час в течение 8 ч с момента инокуляции отбирайте пробу объемом 1 мл из каждой культуры лизогена. 1.4. Сразу после сбора проведите серийное разведение пробы, добавив 100 мкл пробы в 900 мкл соответствующей среды. Тщательно перемешайте на вортексе на максимальной скорости, меняйте наконечник при каждом разведении и продолжайте серию разведений от 10⁻¹ до 10⁻⁹. 1.5. Нанесите по 10 мкл необходимых разведений в трех повторностях на чашку с агаром LB, дайте им высохнуть и инкубируйте при 37 °C в течение 18–24 ч. 1.6. Чтобы рассчитать количество жизнеспособных бактериальных клеток, выберите разведение с легко подсчитываемым количеством колоний. Подсчитайте число колоний в каждой точке, а затем используйте следующую формулу: ПРИМЕЧАНИЕ: По мере роста культуры лизогена в результате спонтанной индукции будут вырабатываться активные фаговые частицы. Продукция инфекционных фагов означает, что транскриптом популяции лизогенов теперь загрязнен экспрессией генов, связанных с литическим циклом репликации, вызванной сигналом литической репликации фага и соответствующим ответом клетки-хозяина. Таким образом, важно определить стадию роста, при которой соотношение лизогенных клеток к свободным инфекционным фаговым частицам максимально, чтобы максимально ограничить фоновый транскрипционный шум (генерируемый транскриптомом литического фага) в наборе данных. 1.7. Для подсчета инфекционных фаговых частиц в каждой временной пробе инокулируйте 5 мл стерильного 0,4% бактериологического агара в среде LB (верхний агар) 100 мкл индикаторного хозяина в середине экспоненциальной фазы (OD600: 0,4–0,5; в данном случае PAO1-RifR) в присутствии соответствующего селективного агента (в данном случае 50 мкг·мл⁻¹ рифампицина, так как МПК для хозяина PAO1 составляет всего 16 мкг·мл⁻¹). 1.8. Нанесите по 10 мкл того же серийного разведения (см. пункт 1.4) на инокулированный слой верхнего агара, дайте ему высохнуть перед инкубацией при 37 °C в течение 18–24 ч. 1.9. Для расчета количества инфекционных фаговых частиц выберите разведение с легко подсчитываемыми бляшками. Подсчитайте число бляшек в каждой точке. Определите время/условие, при котором спонтанная индукция на одну КОЕ (колониеобразующую единицу) минимальна, для последующих этапов эксперимента. Кришнамурти, Р., и др. Изучение влияния умеренных бактериофагов на их лизогены с помощью транскриптомики. J. Vis. Exp. (2024).
В этом видео демонстрируется временное количественное определение спонтанной индукции фагов у лизогенных Pseudomonas aeruginosa путем подсчета жизнеспособных бактериальных клеток (КОЕ) и инфекционных фаговых частиц (ПОЕ) с течением времени. Благодаря отбору проб через определенные интервалы во время роста и анализу образования колоний и бляшек данный метод позволяет определить время, когда спонтанная индукция минимальна. Это дает возможность выявить оптимальные временные точки для последующего транскриптомного анализа с минимальным влиянием литического цикла.
